核酸的一级结构.docxVIP

核酸的一级结构是指构成一个核酸分子的各个核苷酸结构单元或者碱基的排列顺序。在书写核酸一级结构的时候，习惯从左到右按5apos;到3apos;的方向书写。例如，5apos;pGATCGGAAATC-OH?3apos;。这段序列中的5apos;和3apos;完全可以省略掉。作为遗传物质的DNA是以一级结构的形式贮存信息的，因此要了解DNA分子中所蕴涵的遗传信息，必须先确定它的序列。1977年，Frederick?Sanger发明了双脱氧法（Dideoxy?method），Maxam和Gilbert?发明了化学断裂法（chemical?cleavage?method）。可以说，这是两种最经典的测序方法，通常被视为第一代测序的方法。从那时起，DNA测序技术已经历了几代的变化。这里按“代”来划分，充分反映了测序技术在速度和成本上已连续经历了多次重大的发展和进步。（一）?第一代DNA测序第一代测序用的最多的是双脱氧法，而化学断裂法只在一些特殊情况下使用。尽管在当今的基因组测序中，有许多新的测序技术取代了双脱氧法，但双脱氧法引入的几个重要的概念几乎仍然被用在大多数新的测序技术中。1.?双脱氧法1951年，Sanger测定了牛胰岛素的一级结构，后来因此获得第一次诺贝尔奖。在上世纪七十年代刚开始转向核酸序列测定这一课题研究时，他和他的同事们沿用了蛋白质序列测定的基本思路：首先用低浓度的酶将待测的核酸分子降解为若干相互重叠的大片段，分别分离出这些片段，分别再次用低浓度的酶降解，直至得到的一组相互重叠的小片段。测出这些小片段的序列，通过它们之间相互重叠的区域推算出核酸序列。这种方法的工作量显然太大、可行性差，因此简单套用蛋白质序列测定的方法是失败的。双脱氧法的特点在于将生物体内DNA复制的酶学过程应用到序列测定中。首先，待测的双链DNA可以被克隆到单链噬菌体载体而产生单链DNA，或者直接通过碱变性、热变性的方法直接得到单链DNA。根据已知序列合成的特定引物与上述单链模板褪火后，在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP的混合物为底物，合成一条与模板链互补的DNA链。如果四种脱氧核苷酸中有一种或几种的α-磷带有放射性标记，那么，新合成的链将被放射性同位素标记。在正常反应条件下，只要有足够的dNTP存在，DNA链将沿着5′→3′一直延伸到模板的末端。但是，如果在反应混合物中加入一种脱氧核苷酸类似物，即2′,3′-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于它的脱氧核糖无3′-OH，一旦它参入到DNA链上，反应在参入处提前终止。因此，只要控制反应体系中dNTP（其中有一种带放射性标记）和ddNTP比例，就可以得到一组长短不同的具有相同起点的片段。测序通常需要做四个平行的反应，每个反应除加四种dNTP以外，仅加入一种ddNTP。例如，某反应中加入了ddATP，那么在一定的长度范围内，所有新合成的DNA片段由于参入ddATP而导致的意外终止，在3′-端都是A。因此，在ddATP浓度适当的情况下，所有新生链中A的位置都会对应于相应长度的DNA片段。将四组反应产物通过高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再经放射自显影，就可以从图谱上按片段从小到大，读出新生DNA链的碱基排列顺序，根据碱基互补配对的原则很容易得出模板链的序列。2.?化学断裂法化学断裂法首先将待测定的DNA片段的一端（3′-端或5′-端）进行放射性标记，然后在适当的条件下，用专一性的化学试剂特异性地修饰DNA分子上的某种或某类碱基，并控制反应条件，使每条DNA链上平均仅有一个碱基被修饰。然后从DNA链上除去已被修饰的碱基，并通过不同的化学处理使DNA在这个部位被切断。得到的各种长度的带放射性标记的片段并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。裂解DNA的过程包括：有限的碱基修饰、修饰碱基从核糖上脱离及5′,3′两侧磷酸二酯键断裂三步反应。例如硫酸二甲酯在pH?8.0条件下可以使DNA上鸟嘌呤N7位进行甲基化，甲基化使C8-C9键对碱裂解有特异的敏感性，极易水解；哌啶甲酸在pH?2.0下可以使嘌呤环的N原子质子化而脱嘌呤，并可使DNA链仅在鸟嘌呤残基处断裂。如果同位素标记在5′-端的话，这样就产生了一条DNA单链分子5′-端有放射性同位素标记，另一端的下一个碱基为鸟嘌呤。当然还需要同时在完成针对其他三种碱基的特异性裂解反应，通常可以通过酸的作用削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键，哌啶甲酸进而脱去嘌呤并切断磷酸二酯键。如果将这组结果与鸟嘌呤的结果在相邻的加样孔电泳的话，通过比较很容易推断出腺嘌呤的位置。肼在碱性条件下进攻胸腺嘧啶和胞嘧啶的C4位和C6位，然后在哌啶甲酸的作用下脱去碱基并进一步导致DNA链断裂。在1.0?mol/L?NaCl存在下，肼与胞嘧啶发生专一性反应，这样就可以在C和C+T两组产物中区分C和T。在所有碱基