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细胞自噬与肿瘤 肿瘤：机体在各种致癌因素作用下，局部组织细胞在基因水平上失去对自身生长的调控，导致机体异常增生而形成的新生物。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 一、自噬简介二、自噬研究方法三、自噬与肿瘤的关系 目录 肿瘤：机体在各种致癌因素作用下，局部组织细胞在基因水平上失去对自身生长的调控，导致机体异常增生而形成的新生物。 一、自噬简介 1.1 自噬过程 (1) 在饥饿、氧化应激损伤等情况下，自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物周围； (2) 分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体； (3) 自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。 损伤：致伤因素作用于机体，引起组织破坏与功能障碍。 自噬过程 2.1 自噬的功能： （1）对外源性刺激的适应性反应； （2）细胞保持稳定状态的管家机制； （3）参与一定的组织特异性融合； （4）作为一种细胞死亡程序诱导细胞主动性死亡。 适应：生物体能够因环境的变化形成新的遗传形状而是自己顺应环境，称为适应。 反应：活组织接受刺激后发生的功能改变。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 自噬发生过程的分子机制 自噬的研究方法 目前普遍采用的自噬检测方法包括电镜、免疫荧光、蛋白质印迹等方法检测自噬体及其标志蛋白。 准确评估自噬不仅包括自噬体的检测，还包括动态观察整个自噬性降解的过程是否顺畅(即自噬潮分析)。 另外，通过药物或基因干预技术来人为地调控自噬以观察其在体内体外模型中的作用也是自噬分析的重要内容。 任何一种方法单独应用均不能作为自噬的依据，不能将自噬体的增多减少或自噬相关蛋白表达的高低等同于自噬的增强或减弱[1]。 免疫：指机体事变和排除非己抗原异物，以维护内部环境平衡和稳定的生理功能。其功能包括防御、自身稳定和免疫监视三方面。 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 1、自噬性结构的电镜下形态学观察 透射电子显微镜是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构。 电镜观察仅能证明自噬性结构的存在，难以反映自噬活性的强弱。Swanlund 等[2]介绍了一种免疫金电镜技术来对电镜结果进行定量分析。通过图像分析软件自动测量所有自噬囊泡的面积(μm2)，如果一个细胞胞浆中被自噬性囊泡所占据的总面积增加，则可说明自噬机制的上调。 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 免疫：指机体事变和排除非己抗原异物，以维护内部环境平衡和稳定的生理功能。其功能包括防御、自身稳定和免疫监视三方面。 2、基于自噬体标记蛋白LC3 的检测方法 自噬过程由一系列自噬相关蛋白(Atg 蛋白)介导完成，这些蛋白质在自噬体形成的不同阶段发挥作用.。细胞内存在两种形式的LC3 蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(PE)偶联形成LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜。LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记。 磷脂：含有磷酸成分的脂。分为甘油磷脂、鞘磷脂。 2.1、 细胞免疫荧光 LC3-Ⅰ在胞浆内弥散分布，LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上，通过免疫荧光的方法检测内源性LC3或转染GFP-LC3 融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增多。理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。 但是这种方法仅从总体上大致反映自噬的增加或减少，定量分析则存在局限性。 细胞免疫：系指由T细胞介导的免疫反应。现知T细胞表面有免疫球蛋白作抗原受体。 总体：根据研究目的而确定的性质相同的所有观察对象的某种指标测量值的集合。  GFP-LC3 单荧光自噬指示体系： 绿色斑点增多也并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。 2.2 、LC3 蛋白转化 实验 自噬发生后，通过Western-blot 可以检测到两个条带的蛋白质。由于在自噬时细胞