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X单细胞转录组测序原理和文库构建注意要点会计学10第1页/共11页目 录10X单细胞转录组简介10X单细胞转录组测序的技术要点10X单细胞外出试验流程10X单细胞建库流程常见问题10第2页/共11页10X单细胞转录组测序简介 10x Genomics 单细胞转录组测序的技术核心利用「微流控芯片」对细胞进行精确区分，通过「10x Barcodes」标记每一个细胞，能实现大规模的单细胞转录组测序，从而更高分辨率地揭示细胞间的细胞差异以及其在微环境中的功能情况，在细胞异质性研究中表现出色。▽ 研究领域细胞异质性研究免疫反应定点编辑基因的细胞水平研究发育及分化新型细胞发现构建细胞图谱▽ 技术优势不需要微量扩增，降低假阳性率灵活的获取量，可一次性对500-10000个细胞建库，提高效率7分钟之内即可完成单细胞体系制备，捕获效率高达65％成本低，广泛的研究应用领域，超短的项目周期▽ 细胞类型生殖细胞、胚胎细胞、神经细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、其他原代细胞10第3页/共11页10X单细胞转录组测序的技术原理10X单细胞转录组测序：是如何实现单个细胞的分离的？是如何区分不同的细胞以及同一细胞中同一基因的不同转录本的呢？微流控技术Barcoding技术第4页/共11页Barcoding技术10第5页/共11页10X单细胞外出试验流程a/ 细胞悬液制备（客户完成） 细胞悬浮缓冲液：1XPBS with 0.04%BSA 细胞浓度范围：700-1200 cells/ul 细胞活性：≥80% 血液提取、磁珠纯化、流式分选、组织解离等。流式分选组织解离b/细胞活性和浓度的测定 用台盼蓝对细胞进行染色，用细胞计数仪进行细胞活 性和浓度的计数；细胞悬液不宜在冰上放太久，30分 钟内使用最佳。c/准备单细胞Master Mix 提前将试剂拿出化冻备用，在冰上配置Master Mix。d/组装芯片 手持芯片边缘将芯片放入芯片架，样本数不足8个， 需要向用不到的通道内加入50%甘油，不要向回收 孔中加入50%的甘油① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧10第6页/共11页e/ 混合单细胞悬液、Ｍaster Ｍix和水 根据目标捕获细胞数和细胞浓度确定上样体积和水 的体积，先向Mix中加入水再加细胞悬液，细胞悬液 加入Ｍaster Ｍix前用移液器重悬细胞悬液。不要直接 混合细胞和水。f/ 将Master Mix，水和细胞的混合物，Gel Beads以及 Partitioning Oil加入芯片中 按①-②-③的顺序分别添加 样品和Master Mix、Gel Beads和Partitioning Oil。要尽量减少芯片装载和运行 的间隔时间。10第7页/共11页g/运行Chromium Controllerh/转移GEMs 枪头不要紧贴孔的底部，同时避免产生气泡， 取出移液器，确保吸头中没有气泡产生i/用回收溶液破裂GEMs10第8页/共11页10X单细胞文库构建片段化、末端修复加A尾预先设定好PCR仪到4℃，在冰上准备片段化反应体系。吸液体积要准确，取上清（去大）和去上清（去小）都不要吸到磁珠，使用新配的80%乙醇，磁珠晾干时间不超过1min。SPRI磁珠双端纯化冰上配置接头Mix接头连接接头后纯化Index PCR根据建库起始量计算循环数，Index 核对无误。SPRI磁珠双端纯化同上一步双端纯化10第9页/共11页常见问题Q1:细胞悬液中杂质较多，一方面会影响计数的不准确，细胞浓度偏高，细胞活性偏低； 另一方面会导致芯片的堵塞。Q2：细胞直径较小（~5um），不在计数仪有效计数的大小范围；细胞小，染色后容易 被当成死细胞计数，导致细胞活性比实际的活性低。Q3：GEMs生成异常问题。包括堵塞、Wetting Failures（无GEMs生成、生成的GEMs 颜色不均一）、GEMs生成量不足。第10页/共11页谢谢！