放射配基受体结合法.pptxVIP

放射配基受体结合法 一、受体制备 1、目得:受体制备就是在放射配基结合实验前将含有某种受体得组织进行预处理,使之更符合实验得要求。 2、步骤 1)将组织或细胞在低渗缓冲液中匀浆。通常大部分受体在数小时就是比较稳定得。但为了保持活性,经常将组织尽快地放置在冰内。纤维组织,例如肺,应该用尼龙网(～50μm)加以过滤。 2)慢速离心(500g)可帮助除去组织中某些不需要得部分(细胞核及大碎片) 。 3)将匀浆在尽可能快得转速下离心5-10min,但不要用超速(即50,000g)。尽管对于很多受体并不需要低温,但离心常规就是在4℃下进行。 4)将沉淀用相同缓冲液再度匀浆与离心。最终得组织制备被称为粗微粒部分或膜部分。 5)两步离心得目得就是去除任何可溶性干扰物,如内源性得神经递质、鸟嘌呤核苷酸等,它们可能干扰放射配基结合测定。 3、注意事项 1)匀浆缓冲液 匀浆缓冲液得选择通常不就是关键,对于大部分受体制备,在中性pH下得任何缓冲液已经足够。对于某些受体推荐在匀浆缓冲液与/或温孵液中加入EDTA,以完全去除各种内源性物质。 质 2)受体制备得贮存 大部分在冷冻下就是稳定得,原组织或膜部分均能贮藏在-20℃或-80℃一段时间。某些受体与小块组织(10mg)储存后效果不好,应该用新鲜组织进行测定。 二、放射配基 对于任何受体系统,商业上可提供若干种放射配基,要根据放射配基得特征与要解决得问题加以选择。应考虑得问题包括:放射性同位素得种类(通常就是3H或125I),非特异结合得程度,放射配基对受体得选择性与亲与力以及放射配基就是激动剂还就是拮抗剂等。 1、放射配基得种类 3H放射配基得优点就是在化学上较稳定,生物学上与非标记得化合物没有差异,有较长得半衰期(12年),标记配基经常使用数月或更长时间,但它得特异活性较低(30-100Ci/mmol)。 而125I得半衰期短(60天),它得放射配基通常每4-6周购买与准备一次。碘标放射配基得优点就是比较高得特异活性(2,200 Ci/mmol),在受体密度低与组织数量少时特别有用。使用碘标配基不需要闪烁液,免除了购买闪烁液得费用与操作步骤,因而方便与价廉。 2、放射配基得亲与力 放射配基与受体亲与力越高越好,因为测定中可以使用较低浓度得放射配基,且非特异结合得水平也较低。另外,亲与力越高,解离速率越慢,操作较方便。 3、放射配基得稀释 有时,为了将一个测定管得特异活性得最大值限制在106计数/min(cpm),可以用非标记配基稀释125I放射配基,从而降低其特异活性。另外,非标记配基应该使用非活性得含碘配基,而不就是非碘得配基,因为后者与放射配基在化学上就是不同得,可能有不同得药理学特征。 4、放射配基得总结合 通常放射配基得非特异结合越低越好。一个测定中如果50%总结合就是特异得,它被认为就是合格得;70%就是好得,90%就是非常好得。 三、温孵条件 1、时间与温度 对于饱与与竞争结合,所用得模型就是平衡实验。温孵得时间要足够长,以保证达到平衡(或至少就是稳态)。 由于达到稳态得时间依赖放射配基得浓度,在预测温孵时间时,应使用低浓度得放射配基。室温下,使用接近它们Kd得浓度,20-60min可达到稳态。如果在20与60min之间结合就是恒定得,那麽可选定温孵时间为30min。 尽管有人认为生理温度(37℃)更好,但实际上在室温下(22℃)测定最为方便。另外,某些测定选在冰中(4℃)进行,因为在这个温度下得数据重复性较好。 大家学习辛苦了，还是要坚持 继续保持安静 2、缓冲液 通常缓冲液pH在生理范围,即pH7与8之间。实验中经常使用Tris作为缓冲液,主要原因就是使用方便,因为商品Tris就是预先配制好得,不需要调整pH。但Tris不一定就是最好得,可试用其它得缓冲液。 3、放射配基得浓度 在测定中,放射配基采用得浓度要依据实验得类型。对于动力学实验,浓度应较低,只要保证测定计数(例如＞300cpm)即可,大约为0、2×Kd较好。对于竞争实验,使用相似得浓度,约为Kd或更低一些。对于饱与实验,如果可能,放射配基浓度范围应该就是～0、1×Kd～10×Kd。如果放射配基与一个以上受体位点结合,对高亲与力位点(低Kd)应采用0、1×Kd,对低亲与力位点(高Kd)应采用10×Kd。 4、受体浓度 在合理得范围内,组织(