蛋白质的分离纯化课件.pptxVIP

;高效液相-HPLC（High-Performance Liquid Chromatigraphy）;介质一般为在高压下稳定的衍生化硅胶，颗粒小（1-10 μm），可提高理论塔板数到10万/m。 要求有较自动的进样装置，高压泵，和预装住。 有较自动的商品化的系统供应;?KTA FPLC;The principle of chromatography;保留时间;色谱保留;;塔板理论Plate theory; 塔板理论的假设： 1.假设柱中由大量的分离层或理论塔板组成. 2.样品在流动相与固定相之间的分离平衡在每个塔板中进行.被分析物在沿柱向下流动时从一层塔板向另一层塔板进行转移。 3.在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； 4.试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；每次分配的分配系数相同。;考虑分配系数为1 及有限个理论塔板数;塔板数的确定; 色谱柱长：L， 虚拟的塔板高度：H plate hight 色谱柱的理论塔板数：N number of theoretical plate 则三者的关系为： N = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：;对塔板理论的讨论;柱效(Column Efficiency); 组分保留时间： 色谱峰变宽： ;1. Thermal dynamic equilibrium;对分配系数的讨论;Capacity factor容量因子;选择性(Selectivity);目标: 分离度(Resolution);为了提高分辨率 Rs 加大保留时间的差别 减少峰宽 ;;分离度的表达式：;选择性因子a; a : Choosing a different type of molecular interaction by changing stationary phase k : changing temperature or mobile phase N : length of column H : flow rate, particle size of packing, viscosity of the phase ;4.2 分子筛层析凝胶过滤;分子筛;Scanning electron micrographof an agarose gel. Magnification x 50,000.Ref. Anders S. Medin,PhD Thesis, Uppsala University 1995. ;分子筛又称为凝胶过滤（Gel Filtration， Gel Permeation ），体积排阻（ Size Exclusion ） 其介质是由直径大小为0.1mm的不溶于水的,亲水的,惰性的颗粒(Beads)组成. The beads are composed of dextran polymers (sephadex), agarose(Sepharose瑞典，Bio-gelA美国，segavac英国) polyacrylamide (Sephacryl or BioGel P) etc. ;凝胶过滤色谱 基于大小不同的蛋白从限定大小颗粒内径的层析柱中进行洗脱体积(或流速一定时的洗脱时间)的差别 蛋白越小,在柱中的保??时间越长, 洗脱体积越大, 洗脱时间越长 对于蛋白的聚集敏感.;Gel Filtration Chromatography;凝胶过滤色谱的基本术语;;Vo = 外体积, 孔隙体积, 外水体积 (outer volume, the excluded volume surrounding the beads) 基质颗粒之间体积的总和 可用蓝色葡聚糖2000(2000Kd)测定. the void volume all sample molecules have access to the liquid between the beads ~30% ;Vi = 内体积, 内水体积 (Intermediate volume , partially excluded) the pore volumepores allowing the sample molecules to penetrate into the gel filtration beads to different degrees depending on size.;Vg=凝胶本身的体积 the b