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1.2-基因工程的基本操作程序会计学第1页/共45页基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。1、目的基因的获取使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 2、基因表达载体的构建载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 3、目的基因导入受体细胞才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。4、目的基因的检测与鉴定第2页/共45页一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成第3页/共45页1. 从基因文库中获取目的基因1. 基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2. 基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库限制酶反转录第4页/共45页基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 某种生物某个时期的mRNA许多DNA片段cDNA与运载体连接导入与运载体连接导入受体菌群体受体菌群体cDNA文库基因组文库第5页/共45页基因的结构非编码区非编码区编码区原核启动子真核RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子第6页/共45页原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子与RNA聚合酶结合位点：编码蛋白质 ,连续不间断编码区基因结构①不编码蛋白质。非编码区②调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合位点:第7页/共45页真核细胞的基因结构非编码区编码区非编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子与RNA聚合酶结合位点外显子 内含子 外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列基因结构编码区：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。非编码区第8页/共45页原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的，边_________边_________编码区是间隔的、_____的，先_____后_____相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续转录转录翻译翻译编码区非编码第9页/共45页基因文库的构建方法① 基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体导入受体菌中储存基因组文库第10页/共45页② cDNA文库的构建-----逆转录法： 提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA反（逆）转录酶单链DNADNA聚合酶双链cDNA片段与载体连接重组载体导入受体菌中储存cDNA文库第11页/共45页思考？真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？第12页/共45页真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区基因启动子终止子转录RNA聚合酶mRNA前体剪接剪接有关的酶mRNA不含非编码序列。即不含非编码区和内含子逆转录逆转录酶单链DNA复制DNA聚合酶cDNA第13页/共45页基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段） 基因多少 物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以3第14页/共45页前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。 多聚酶链式反应体外特定DNA片段2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶第15页/共45页PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________氢键单链DNAb、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。 双链c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一第16页/共45页PCR技术的操作过程第17页/共45页PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增第18页/共45页PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果主要在细