PTEN在血管重建早期的作用.pptxVIP

PTEN在血管重建早期的作用会计学研究背景及目的第1页/共12页 磷酸酶PTEN是PI3K（磷脂酰肌醇-3-羟激酶）蛋白激酶B（Akt）信号通路的一种重要的生理学抑制剂，在过去的研究中，我们致力于研究在体内和体外情况下PTEN在血管急性损伤后VSMC凋亡方面的作用。然而，PTEN在血管成形术诱导的血管损伤的早期阶段的作用尚不明了。 为了明确该作用机制，我们设计该实验以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用。第2页/共12页技术路线1.体内(颈动脉损伤模型构建)未处理（对照）成年Wistar大鼠（300g)颈总动脉分离PTEN表达量检测12h后球囊损伤血清2.体外：不同生长因子PTEN表达量检测干预24h周期性拉伸装置H2O2 取材（HcASMC）细胞培养至第六代WT-PTEN质粒凋亡VSMC数量检测、Akt磷酸化检测转染SiRNA敲出PTEN基因共转染PTEN/活化的Akt突变体VSMC凋亡数量检测3.汇总数据、统计分析、得出结论第3页/共12页实验结果报告：图1A-D 为了探究血管受损后PTEN的表达及细胞凋亡情况，研究人员对实验大鼠颈动脉进行球囊损伤，12小时后，免疫组化检测各项指标如上图：PTEN (green), apoptotic smooth muscle cells (TUNEL staining,red) and nuclei (DAPI, blue） 由图可知：球扩后损伤较严重的区域PTEN表达量较多，正常细胞数量少、凋亡细胞数量密集（图上半部分）第4页/共12页实验结果报告：图1E-F时间依赖性？微管蛋白western blot：using a specific PTEN antibody 不同时间点PTEN相对表达量 densitometric analysis of immunoblots对经/未经球扩后的标本裂解后通过免疫沉淀反应进行PTEN活性检测： Immunoprecipitations employing an IgG iso-antibody and without addition of any antibodies served as controls由图可知：在大鼠颈动脉受损后12H内，PTEN的表达具有时间依赖性（递增） 与对照组相比，其活性明显高于未受损的大鼠颈动脉标本。第5页/共12页实验结果报告：图2A-E为了探究哪些因素可以诱导PTEN的表达设计如下实验：A:Lysates of cells exposed to mechanical forces using a stretching devicewere analyzed by western blotting using specific antibodies；B:Lysates of SMC exposed to growth medium (FCS). Cdk4（周期素依赖性激酶） served as loading control.C:Lysates of SMC exposed to oxidative stress using 500 mM H2O2. p53 and Cdk4 served as apoptotic marker and loading control,respectively.D：PTEN相对表达量的检测： quantifiedby densitometric analysis of immunoblots E：PTEN的活性检测： phosphatase activity assay of immunoprecip-itated protein from lysatesof HcASMC注：PTEN（抗PTEN抗体） Bpv(一种PTEN的特异性抑制剂)由图可知：PTEN受H2O2的氧化应激刺激后表达显著增加，且上调的PTEN活性可被Bpv抑制。 第6页/共12页实验结果报告：图3A-C为了进一步探究PTEN的上调与SMC凋亡的关系进行如下实验：A:HcASMC transfected with a plasmid carrying WT-PTEN or a control (empty) vector. PTEN protein-expression levels weredetermined by immunoblotting HcASMC were transfected as follows: non transfected (NT); transfected with an emptyplasmid without PTEN-cDNA (pControl); transfected with a plasmid coding for PTEN (pPTEN).B: SMC w