正常和肿瘤组织细胞的培养培训课件.pptVIP

正常和肿瘤组织细胞的培养;内 容; 不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。;上皮细胞的体外培养;上皮细胞的基本特征：;体外培养的上皮组织细胞的生长生物学;2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征;根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、 呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触， 组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。 要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作 步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。 培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及 培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。 ;皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的 贴壁依赖性细胞。 在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基 质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮 细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞 极性表现更为明显。;M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持 其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。 DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。 可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。 HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基 成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。 在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组 织培养。;去除成纤维细胞 上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时 会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮 细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能 力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群， 从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的 “细胞污染源”。 因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程 中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细 胞的生长。 ;(2) 体外培养上皮细胞的形态学变化;体外培养上皮组织细胞的观察与检测;2. 组织化学与免疫组织化??观察与检测 酶类： 碱性磷酸酶 琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物： 角蛋白、上皮细胞膜抗原 VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白;血管内皮细胞的体外培养;人脐静脉内皮细胞的培养;2.培养方法： ;1 ).?将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。 （注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃） 2 ).?用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的 PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。 3 ).?用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。 4 ).?消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。 5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。 ; (1) 关于接种材料的制备 取材与消化 消化酶、浓度、时间 (2) 排除成纤维细胞 传代去除法 加肝素培养法(90u/ml) 刮除法 (3) 关于培养液 (4) 关于传代培养 ; (1) 光镜检查 (2) 透射电镜检查： W-P小体 (3) VIII因子相关抗原的免疫组化检测;肾小管上皮细胞的培养;1. 主要材料： a. 细胞来源： b. 无血清培养液： 基础培养液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物： 胰岛素 5?g/ml 转铁蛋白5 ? g/ml