分子克隆及蛋白表达常见问题和对策.ppt

七、蛋白的诱导表达 各种表达系统的优缺点 七、蛋白的诱导表达 大肠杆菌蛋白诱导表达： 将测序正确的阳性克隆质粒转入BL-21plys大肠杆菌中，选取1-2个单克隆在LB或M9培养基上加入相应的抗生素培养，当菌体生长到OD600至0.7左右加入IPTG或其它诱导剂如乳糖等，诱导6-8小时收菌，超声破壁，离心，用未诱导或空载BL-21大肠杆菌为对照进行SDS-PAGA电泳。 七、蛋白的诱导表达 SDS-PAGA电泳后的胶进行考姆斯亮兰进行染色，对照不出现，而诱导后出现条带且分子量符合预期的视为阳性，诱导成功。 然后检查蛋白在上清还是在沉淀中，确定蛋白的可溶性。 大肠杆菌蛋白诱导表达 可能出现的情况及应对： 1、诱导后蛋白不表达 2、诱导后蛋白为包含体 3、表达的量不高 4、大肠杆菌不能生长 5、大肠杆菌前面生长良好，后期快速消失 七、蛋白的诱导表达 1、诱导后蛋白不表达 这种情况经常会出现，最大的可能性是克隆的基因不正确或者基因表达的阅读框不正确，如诱导2-3次后仍然不表达，建议回到测序的结果中再仔细检查，找到原因 七、蛋白的诱导表达 2、诱导后蛋白为包含体 包含体产生的原因有以下两个方面： -基因本身决定了其不溶性（真核基因/膜蛋白） -表达过快，来不及正确折叠 对于第一种情况，能改变的不多，采用共表达伴侣蛋白进行改善 对于第二种情况，可以通过降低诱导温度，采用温和诱导剂如（乳糖代替IPTG)，加入相关的氨基酸（精氨酸），采用共表达伴侣蛋白效果更佳。 七、蛋白的诱导表达 3、诱导后蛋白表达的量不高 可通过高密度培养，增加细胞量； 可通过增加抗生素浓度减少质粒丢失； 可通过新型蛋白诱导表达方式，如巴奥得的天达1号，使蛋白（可溶性）表达及细胞量均得到明显提高；天达2号使蛋白（包含体）表达及细胞量均得到大幅提高。 七、蛋白的诱导表达 七、蛋白的诱导表达 4、大肠杆菌不能生长 可能的原因有抗生素用错了或要表达的是有毒基因： 有毒基因影响：宿主中质粒不稳定、抑制菌体生长或溶菌、表达量低或不表达 应对办法：启动子调控、抑制本底表达 选择特殊表达载体 PETco-co 选择宿主菌 BL-21（DE3）PlysS, BL-21（DE3）PlysE 包涵体表达 七、蛋白的诱导表达 5、大肠杆菌前面生长良好，后期快速消失 可能的原因是受到噬菌体污染： （1）?发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清； （2）?耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高； （3）产生大量泡末，发酵液呈粘稠状； （4?）菌体不规则，甚至出现畸形。? 一旦出现以上情况，立即进行环境消毒，不要抱有幻想 七、蛋白的诱导表达 噬菌体污染对策： 1?决不使用可疑菌种； 2?清除周围环境中存在的噬菌体。能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作； 3?选育抗噬菌体菌株 4?轮换使用菌株。因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。 药物防治： （1）螯合剂。如植酸盐（0.05~1%），柠檬酸盐（0.2~0.5%），草酸盐（0.2~0.5% ），三聚磷酸盐（0.5~1%）等可抑制噬菌体的吸附或阻止DNA的注入 七、蛋白的诱导表达 药物防治： （2）表面活性剂。0.01~0.2%的聚乙二醇单酯、聚氧乙烯烷基醚、土温20、土温60 等。主要作用于寄主细胞表面，抑制噬菌体在细菌上的吸附。 （3）抗菌素。如1ug/mL的金霉素、四环素、氯霉素等抑制噬菌体蛋白质的合成； （4）?N-脂酰氨基酸。是一类具有16~18个碳原子的衍生物。如20ug/mL的N-棕榈 酰-L-谷氨酸，其作用机制是抑制噬菌体核酸的复制或子代噬菌体的成熟 ? 七、蛋白的诱导表达 真核基因表达的调控——真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。真核基因表达调控的环节更多如前所述：基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核（线粒体基因的转录在线粒体内），翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。 七、蛋白的诱导表达 七、蛋白的诱导表达 图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排（gene rearrangement），即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分