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酶联免疫吸附实验会计学第1页/共43页一、实验目的掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法了解其他免疫标记技术 第2页/共43页二、实验原理 免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IF）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术（酶免疫技术）。第3页/共43页免疫标记技术（immunolabelling technique） 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。抗原抗体反应示踪物标记特异性灵敏性免疫标记技术的主要特点：高度特异性、高度灵敏性第4页/共43页免疫技术 + 标记技术免疫标记技术 =酶荧光素同位素 免疫标记技术放射物标记技术 酶标记技术 免疫荧光技术 其他标记技术酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术第5页/共43页第6页/共43页酶免疫技术(enzyme immunoassay)是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应第7页/共43页酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 第8页/共43页 ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 第9页/共43页ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。第10页/共43页常用酶及其底物peroxidase (POD) 1.辣根过氧化物酶(HRP)常用底物：(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性, 但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。2.碱性磷酸酶(AP)常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价高，故应用不如HRP普及。第11页/共43页Colorimetric ELISA Substrates 第12页/共43页ELISA常用的几种方法?(一)测定抗原的，主要有四种方法 1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。第13页/共43页第14页/共43页第15页/共43页第16页/共43页第17页/共43页(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法. 第18页/共43页三、实验步骤 乙肝病毒存在三对抗原抗体系统1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc） 因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难，故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。 HBV感染后的血清学指标:HBsAg, HBsAb乙肝表面抗原，存