荧光探针定量PCR技术原理及应用(1).pdfVIP

荧光探针定量 PCR 技术原理及应用 PCR 技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测。荧光探针定量 PCR（FQ—PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）” 或“TaqMan PCR （以美国PE 公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR 基础上加入荧光标记探针,巧妙地把 核酸扩增(PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床 实验诊断的常规技术. 1.原理 FQ-PCR 的工作原理［1—3]是利用 Taq 酶的 5’ → 3外切酶活性,在 PCR 反应系统中加入一个 荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA 模板发生特异性杂交，探针的 5端标以荧光报告基团 FAM （6-羧基荧光素,荧光发射峰值在 518 处），靠近 3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹 明，荧光发射峰值在 582n 处）,两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所 激发出的荧光信号被 3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR 反应体系中有目的基因存 在，就会扩增出特异核酸片段,荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当 PCR 进入延伸（复制)期， Tap 酶从引物 3端开始,随新链延伸沿 DNA 模板移动，当移动到探针结合的位置时,其 5’→ 3’端外切酶 活性作用，将探针切断(切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的 淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来(图 1）。PCR 反应每复制一个特异核酸片段，就有一 个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放.由于被释放的荧光基团数目和PRC 产物是一对一的关系，因此用 荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物 的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离,实现了仪器实时检测（图 2),为新的 PCR 定量原理创造了 条件. 图 1。TaqMan PCR 反应模式 (A）聚合反应：(B）链置换; （C)裂解; (D）聚合完成（R：FAM；Q:TAMRA；F ：上游引物；RP:下游引物) 图2.FQ—PCR 实时动力学曲线 ABI 公司首先根据上述原理研制了 ABI 7700 等系列定量 PCR 仪,在 PCR 反应中设置标准模板系 列（一般 5～7 个标准浓度）反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、 △RQ.RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ—代表空白管中二者的比率， △RQ （△RQ = RQ+-RQ-）代表PCR 过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基 线的平均值和标准差，计算出以 99。7%的置信度大于平均值作为阈值）时,标准模板反应管所用的循环次 数（Ct 值）就被记录下来。Ct 值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系［3]，利用系列标准模板 的Ct 值,制成标准曲线（图 3)，根据待测样品的 Ct 值,就可在标准曲线中确定待测样品起始的 DNA 数量。 根据数据处理，即可得出定量结果.探针设计一般应符合以下条件 ［2]:①探针长度应在 20~40 个碱基左右， 以保证结合的特异性。②GC 碱基含量在 40％~60%，避免单核苷酸序列的重复.③避免与引物发生杂交或重 叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的 Tm 值要比引物的 Tm 值 至少高出 5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响. 图 3.FQ—PCR 标准曲线 2。 技术特点 2.1 封闭状态下检测,避免了扩增产物污染而致的假阳性 传统PCR于反应结束后取出反应液，通过电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下 分析，对实险室的污染是不可避免的.因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越 的障碍。FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析,完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。至 于样品间的污染，无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。我国PCR临床应用 出现问题,产物污染所致假阳性是主要原因之一。 2。2 基因的定量检测，扩展了临床应用空间 传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：①PCR 产物在扩增过程中呈指