荧光探针定量PCR技术原理与应用(1).pdfVIP

荧光探针定量PCR技术原理与应用 PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量 PCR （FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用 “实时定量PCR （real time quantitative PCR ）” 或“ TaqMan PCR(以美国PE 公司商标命名) ”。该技术是在常规 PCR 基础上加入荧光标记探针，巧妙地把 核酸扩增（PCR）、杂交与光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床 实验诊断的常规技术。 1.原理 FQ-PCR的工作原理 [1-3]是利用 Taq酶的 5’ → 3’外切酶活性，在 PCR反应系统中加入一个荧光标 记的探针。该探针可与引物包含序列的 DNA模板发生特异性杂交，探针的 5’端标以荧光报告基团FAM （6- 羧基荧光素，荧光发射峰值在 518mm处），靠近 3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光 发射峰值在 582nm处 ) ，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的 荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当 PCR反应体系中有目的基因存在，就会 扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当 PCR进入延伸（复制）期，Tap酶 从引物 3’端开始,随新链延伸沿 DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其 5’→ 3’端外切酶活性 作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬 灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个 探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和 PRC 产物是一对一的关系，因此用 荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物 的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测 图( 2) ，为新的PCR 定量原理创造 了条件。 1 / 23 图 1.TaqMan PCR反应模式 （A）聚合反应： （B）链置换； （C）裂解； （D）聚合完成 （R ：FAM ；Q ：TAMRA ； FP ：上游引物；RP ：下游引物） 图 2.FQ-PCR 实时动力学曲线 ABI 公司首先根据上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR仪，在 PCR反应中设置标准模板系列 （一 般 5~7 个标准浓度）反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出 RQ+ 、RQ- 、△RQ 。 RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ （△ RQ = RQ+-RQ-）代表PCR 过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均 值和标准差，计算出以 99.7%的置信度大于平均值作为阈值）时， 标准模板反应管所用的循环次数 （Ct值） 就被记录下来。 Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系 [3] ，利用系列标准模板的Ct值，制 成标准曲线图( 3) ，根据待测样品的Ct值，就可在标准曲线中确定待测样品起始的 DNA 数量。根据数据处 理，即可得出定量结果。探针设计一般应符合以下条件 [2] ：①探针长度应在 20~40 个碱基左右，以保证结 合的特异性。 ②GC碱基含量在 40%~60% ，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。 ④探 针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的 Tm值要比引物的 Tm值至少高出 5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。 图 3.FQ-PCR 标准曲线 2. 技术特点 2.1 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性 传统 PCR 于反应结束后取出反应液，通过 2 / 23 电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下分析，对实险室的污染是不可避免的。因污染而导致 假阳性，成为 PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越的障碍。 FQ-PCR在全封闭状态下实现 PCR 扩增和产 物分析，完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。至于样品间