莱茵衣藻产氢.pptxVIP

会计学;豆血红蛋白;;;衣藻叶绿体外源基因的转化原理;衣藻叶绿体外源基因转化的方法;实验方法;;;;;(3)PCR反应条件：94℃预变性5min，一个 循环；94℃变性1min，62 ℃(1ba,lbc1, lbc2)、退火3.0s，72℃延伸lmin；30 个 循环；72℃延伸10min，PCR产物4℃保 存 备用。 (4)PCR产物的鉴定：用1％的琼脂糖凝胶 电泳 鉴定DNA的大小。如果大小正确, 则将PCR产物纯化后连接到通用载体 pEGM—Easy—TVector(Promega) (以下简称Tvector)‘上，再送测序公司检 测PCR产物碱基序列的正确性。 ;(5)PCR产物的纯化：DNA胶回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit)：电泳结束后， 切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1．5ml离心管中， 加入3倍体积BindingBuffer，5℃水浴10min直至彻底 融化；将融化的胶溶液转移到柱中，室温放置2min， 8000 r／min离心l min，弃收集管中的废液；取下UNIQ-10柱子，倒掉收集??中的废液，将柱子放入同一个收集管中，加入500ul‘WashSolution，8000‘r／min离心1min；重复清洗二次(重复步骤5)后将UNIQ-10柱子放入一新的1．5ml的离心管中，在柱子膜中央加30uLElutionBuffer(PH7)，室温放置2 min 12000r／min离心1 min，离心管中液体即为回收的DNA片段，可立即使用或．20℃冷藏备用。;载体的构建;以T-lba的DNA为模板扩增lba基因;;;2．5大肠杆菌感受态细胞的制备;大肠杆菌的转化;克隆载体的鉴定;目的基因在大肠杆菌中的表达及蛋白抗体的制备;目的蛋白的SDS(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测;衣藻叶绿体表达载体的构建;第23页/共35页;第24页/共35页;第25页/共35页;．2．5．1衣藻的纯化及培养 (1)藻种纯化培养 培养基为Tris-Acetate-Phosphate(TAP)，初始pH=7.2。在TAP培养基中加入质量1.5％的琼脂粉，制成固体培养基平板，再将待分离纯化的藻液通过划线方法接种在平板上，置于培养箱中，25℃培养，每3-4周继代一次。从平板上挑取单藻落，接入100ml液体培养基中，在培养箱中以(光照强度100uE／(m2 s)PAR，温度25士1℃)。的光强光照静置或水平转速为120rpm培养每5天继代一1次。 (2)莱茵衣藻的扩大培养：在1000ml的三角瓶内加入400mlTAP培养基接种莱茵衣藻(接种量为l％)，摇床培养5-7天左右，转速120rpm，光照强度100umol·m-2.s-1，温度25士1℃。; 用分光光度计测定转基因衣藻849-1ba,cg40、cg40i-i和转基因之前的藻种849的OD750及叶绿素在培养7天内的变化情况，制作生长状态及叶绿素含量变化曲线图;对照组(莱菌衣藻849、cg40，cg40i一I,及转基衣藻849lba的生长和叶绿素含量变化趋势基本一致，藻细胞均在第3天进入对数生长期，第4、5天达到饱和期，之后就趋于平稳；对照组(转基因藻cg40 ． cg401一I, 与衣藻849)的生长速度基本一致，OD750都在第四天达到3.5左右，约等于细胞数为70~80x106个，叶绿素含量达到33mg/L左右，但转基因藻lba的OD750在第四天才达到2.7左右，约等于细胞数为6.0—7.0x106个，低于对照组20％左右；叶绿素含量约为27mg／L左右．低于对照组18％左右。该实验结果说明，Iba基因的转入在一定程度上会影响衣藻的生长。;转基因衣藻849-lba与莱茵衣藻849的耗氧及产氢量比较;第30页/共35页;因为培养基中缺硫能提高衣藻的产氢效率，在TAP．S培养基下，衣藻849和849-lba的产氢量都是在接种后迅速提高，但转lba基因衣藻的产氢量升高得明显比衣藻849快，到第6天约为178ul，比衣藻849高29％(图3．19，B)；此时转lba基因衣藻的产氢速率为2.25ul／mgChl·h-1，也比衣藻849的高82％(图3-19，B)。比较二者培养系统内的氧气含量发现：从接种开始到第3天，转lba基因的衣藻培养系统内的氧气含量下降速度就比849快，从第1天到第3天衣藻849-lba体系的氧气含量从22％降到3％，比衣藻849的大约低约82％(图3．19，b)。;lba基因的转入对衣藻耗氧和产氢量的影响; 本实验将能与氧气可逆结合的豆血红蛋白基因lba转入到衣藻的叶绿体