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基因组文库构建会计学第1页/共53页 cDNA文库(cDNA library) ： 克隆的重组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多克隆的过程，最终可建立cDNA文库。第2页/共53页建库的目的：1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；文库中分离稀有的cDNA克隆。建库的关键：如何产生足够数量的重组DNA建库应注意：和靶DNA均不被外源DNA序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。第3页/共53页第4页/共53页 第一节 DNA克隆片段的产生与分离的片段化 1.用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算， 基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。第5页/共53页2.随机片段化： 超声波：可产生300bp的短片段。高速搅拌：1500转/分×30分 可切 平均长度8kb的分子群体。单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载体容量，如?噬菌体插入片段不超过25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp. 第6页/共53页双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分子量可达10～30kb,它们存在着随机序重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为20kb的随机DNA片段群体。二. DNA片断大小的分部 如已知含目的基因克隆片段的大小范围，可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分离。三.目的基因克隆片段的富集。第7页/共53页任一DNA序列在文库中出现的概率： N:该序列需要克隆的总数；p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99％；I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb;G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp第8页/共53页将数据代入上式 = 8.1×105N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.1×105 以上时，才能以99％的概率得到此克隆。第9页/共53页五. cDNA文库一.概况:cDNA文库是通过反转录mRNA，并制备双链cDNA(double stranded cDNA)来构建的。构建cDNA文库的策略是取决于：(1)目的mRNA的相对丰度；(2)筛选方法： 除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各种方法进行鉴定。第10页/共53页cDNA文库的优点(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5) cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。第11页/共53页但应注意：(1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。第12页/共53页分离代表细胞中主要mRNA(rRNA和tRNA因其丰富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。mRNA的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。然后被反转录。cDNA第一链的合成用oligo(dT)引物，因为长的mRNA没有被完全反转录,因此中部可加另一引物。第二链cDNA的合成是用自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第一链加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)为引物起始第二链的合成。这样产生的双链cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。第13页/共53页第14页/共53页第二节 构建文库的载体基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。第15页/共53页 置换载体—Spi-表型(对P2感染敏