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基因工程概论会计学第1页/共53页4 目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。第2页/共53页4 目的基因的克隆与基因文库的构建A鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性第3页/共53页鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。 第4页/共53页鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。第5页/共53页鸟枪法克隆目的基因的基本战略转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。 第6页/共53页鸟枪法操作的改进使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率。 第7页/共53页鸟枪法操作的改进在连接前将DNA片段进行分级分离 例如：已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进2.0 kb1.8 kb1.6 kb行拼接。第8页/共53页鸟枪法操作的改进凝胶DNA片段回收技术 冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法第9页/共53页鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构第10页/共53页4 目的基因的克隆与基因文库的构建B cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性5‘ppp’55‘ppp’55‘ppp’5AAAAAAAAAAAAAAOH 3’G G G G G G 第11页/共53页cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA第一链的合成 mDNA引物退火AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’逆转录酶dNTPsAAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’cDNA第一链5‘ppp’5G G 第12页/共53页cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA第二链的合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失。AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’NaOH煮沸TTTTTTTTTTTTTTp 5’OH 3’KlenowdNTPsTTTTTTTTTTTTTTp 5’AAAAAAAAAAAAAAOH 3’S1TTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G G 第13页/共53页cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失。AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’RNaesHDNApol dNTPs AAAATTTOH 3’5’TTTTTTTTTTTTTTp 5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH 3’AAAAAAAAAAAAAAp 5’S1T4-DNA ligase5’TTTTTTTTTTTTTT 3’3’AAAAAAAAAAAAAA 5’5‘ppp’55‘ppp’5G G G G 第14页/共53页cDNA法