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基因工程的基本操作程序 公开课会计学第1页/共44页1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第2页/共44页一、目的基因的获取1.目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。符合人们需要，能编码蛋白质的基因2.基因文库 P9第3页/共44页第4页/共44页基因组文库：含有一种生物的全部基因种类部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库第5页/共44页①基因组文库的构建某种生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段与载体连接重组DNA导入受体菌中储存基因组文库第6页/共44页② cDNA文库的构建-----逆转录法： 生物某个发育时期的mRNA反转录酶单链DNADNA聚合酶双链cDNA片段与载体连接重组DNA导入受体菌中储存cDNA文库第7页/共44页基因组DNA文库与cDNA文库的比较第8页/共44页3.获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成第9页/共44页（1）从基因文库中获取目的基因依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性第10页/共44页（2）利用PCR技术扩增目的基因① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。 多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制②原理：__________第11页/共44页模板DNA95℃DNA引物50℃第12页/共44页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理引物1引物2DNA引物72℃第13页/共44页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理Taq酶引物1引物2Taq酶72℃第14页/共44页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第1轮结束第2轮开始95℃50℃72℃第15页/共44页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理TaqTaqTaqTaq72℃第16页/共44页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第2轮结束第17页/共44页a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________③过程：氢键单链DNAb、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。 双链c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 DNA链第18页/共44页指数2n④方式：以_____方式扩增，即____已知基因的核苷酸序列⑤条件：前提条件:________________⑥ 结果：短时间内大量扩增目的基因第19页/共44页PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所解旋方式酶主要在细胞核内体外复制解旋酶高温细胞内的DNA聚合酶热稳定的DNA聚合酶第20页/共44页（3）人工合成法： 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学合成法 、 反转录法mRNADNA推测DNA合成仪合成推测第21页/共44页DNA蛋白质根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：二、基因表达载体的构建（核心）第22页/共44页1.目的A. 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代B.同时使目的基因能表达和发挥作用第23页/共44页2.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因DNA连接酶重组DNA第24页/共44页3.基因表达载体的构建过程质粒限制酶目的基因第25页/共44页限制酶（1）用_________切割质粒，使其出现切口露出____________。（2）用___________切割目 的基因，使其产生_____ ____________。黏性末端同种限制酶相同的黏性末端（3）将目的基因插入质粒的______处，加入___________，形成了一个重组DNA分子切口DNA连接酶第26页/共44页三、将目的基因导入受体细胞------转化目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第27页/共44页1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:a.能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上表达整合导入转入第28页/共44页表达载体植物细胞农杆菌新性状Ti质粒目的基因植物细胞染色体DNA构建第29页/共44页（2）基因枪法------单子叶植物第30页/共44页（3）花粉通道法我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得第31页/共44页2、将目的基