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基因工程的基本操作程序会计学第1页/共46页基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。1、目的基因的获取使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 2、基因表达载体的构建载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的获取第2页/共46页编码蛋白质的结构基因(一)、目的基因主要是______________________请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成第3页/共46页一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因种类部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：第4页/共46页5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库第5页/共46页5.基因文库的构建方法之反转录法：cDNA的合成流程图解某种生物的单链mRNA反（逆）转录酶单链互补DNADNA聚合酶双链cDNA片段与载体连接导入受体菌中储存cDNA文库第6页/共46页基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较原理：DNA复制聚合酶链式反应 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 体外特定DNA片段第7页/共46页2、利用PCR技术扩增目的基因第8页/共46页条件：模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸(dNTP) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶）Mg2+(激活剂)缓冲溶液一对引物：一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物第9页/共46页过程 预变性（增加DNA变性的概率）高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）重复循环第10页/共46页2、具体过程第11页/共46页PCR(多聚酶链式反应) 第12页/共46页聚合酶链式反应① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 特定DNA片段体外DNA复制②原理：__________③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.等要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数）⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增第13页/共46页⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________氢键单链DNAb、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 双链c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 DNA链第14页/共46页PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第15页/共46页3、人工合成的目的基因目的基因的mRNA1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。反转录单链DNA (cDNA）合成双链DNA(即目的基因)2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：结构基因的核苷酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因推测化学合成推测二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心第16页/共46页1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?第17页/共46页2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?第18页/共46页启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶