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基因工程的基本操作程序63047会计学第1页/共35页基因工程基本操作程序主要包括四个步骤：（1）目的基因的获取（2）基因表达载体的构建（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定第2页/共35页一、目的基因的获取（一）目的基因：主要是___________的基因编码蛋白质如：与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因 与生物药物和保健品相关的基因 与毒物降解相关的基因 与工业所需酶相关的基因也可是具有调控作用的因子（如增强子等）第3页/共35页（二）目的基因的获取方法：1、从基因文库中获取（1）基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库（2） 基因文库的种类：部分基因文库第4页/共35页基因组文库：包含了一种生物的所有基因，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。部分基因文库：包含了一种生物的部分基因，如cDNA文库。第5页/共35页基因组文库的构建方法： 提取某种生物的全部DNA用适当的 限制酶切 一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库第6页/共35页cDNA文库的构建方法-----反转录法某种生物的单链mRNA 逆转录酶 （反转录酶）合成互补DNADNA聚合酶形成双链DNA（即cDNA）与载体连接导入受体菌中储存cDNA文库第7页/共35页知识补充： 原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子编码区: 能编码蛋白质的序列非编码区: 不能能编码蛋白质的序列（含基因表达的调控序列）第8页/共35页真核细胞的基因结构外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能编码蛋白质的序列叫做内含子内含子： 第9页/共35页真核细胞的 基因结构外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列编码区非编码区：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。包括非编码区和内含子非编码序列：第10页/共35页基因组文库和cDNA文库比较：第11页/共35页（3）从基因文库中得到目的基因的方法：依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性2、利用PCR技术扩增目的基因第12页/共35页（1）PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，短时间内大量扩增目的基因。（2）原理：DNA双链复制DNA模板引物（一对） 4种脱氧核苷酸 Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）缓冲液（3）条件：第13页/共35页变性、退火、延伸三步曲（4）过程：① 变性：90 ℃ ～95℃ 双链DNA→单链DNA② 退火：55℃ ～60℃引物与单链DNA模板结合(碱基互补配对)③ 延伸：70 ℃ ～75℃ Taq酶的作用下，从引物起始进行互补链的延伸第14页/共35页每循环一次，目的基因可增加一倍，呈指数形式（2n）扩增。（5）结果： PCR扩增仪第15页/共35页PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对原则4种脱氧核苷酸模板、能量、DNA聚合酶DNA在高温变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子3、人工合成法第16页/共35页如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建 — 基因工程的核心1、构建表达载体的目的：① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以 遗传给下一代；② 使目的基因能够表达和发挥作用。第17页/共35页2、基因表达载体的构成及作用：启动子目的基因终止子标记基因复制原点第18页/共35页启动子： 位于基因首端的一段有特殊结构的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位；作用：驱动基因转录出mRNA终止子：位于基因尾端的一段有特殊结构DNA片断。作用：使转录终止第19页/共35页注意：启动子与终止子不同于起始密码和终止密码 启动子与终止子位于DNA上，是DNA片段，与基因的转录有关。起始密码和终止密码位于mRNA上， 是3个相邻的碱基，与翻译（蛋白质的合成）有关。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来（如抗生素抗性基因）。第20页/共35页第21页/共35页 克隆载体与表达载体的构成： 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片 段。表达载体在克隆载体基础上增加了启动 子、终止子，启动子、终止子对于目的基因 表达必不可少。第22页/共35页三、将目的基因导入受体细胞1、转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体