大肠杆菌感受态细胞及其制备.pptxVIP

会计学1大肠杆菌感受态细胞及其制备 什么是感受态细胞（Competent cell ）？ 细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞。第1页/共22页 作为感受态细胞应具备什么特点？（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）*。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。第2页/共22页 4感受态细胞可以用来做什么？将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。第3页/共22页 制备感受态的方法 化学方法 电击法CaCl2 制备法氯化锂制备法（毕氏酵母）第4页/共22页 电击法与CaCl2 制备法的区别原理： 电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。 CaCl2 法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42℃，90s）变得很容易从溶液中摄取DNA。第5页/共22页 其他： 做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。另外，需要专门的仪器。 化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。下面详细介绍CaCl2制备法。第6页/共22页 CaCl2制备法原理 在CaCl2溶液中，细胞会发生膨胀，Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。第7页/共22页 9仪器及设备 高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等。离心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等。培养基及试剂 液体LB培养基、无抗平板、Amp平板、带Amp抗性的质粒、100mM CaCl2 溶液（含15%甘油）。第8页/共22页 准备工作所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、EP管以及装培养基的容器最好是专用。洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）离心杯、EP管灭菌后置于-20℃预冷备用。自封袋写上感受态名称、批号。第9页/共22页 划板从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存。在划线板上做好相应标记，于37℃培养16-20小时。第10页/共22页 接种在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20μl枪头（或者灭过菌的牙签），挑取单克隆，放入装有LB的试管中，将试管置于37℃恒温摇床培养10-12小时。第11页/共22页 转接将过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于１:１０，即转接菌液:培养基体积≦ １:１０ 培养基体积与三角瓶体积比不得小于１:５，即 培养基体积:三角瓶体积≧ １:５ 要有足够的空间提供溶氧。第12页/共22页 转接完成后，置于37℃，220r/min培养1小时左右。检测OD600值，一般OD600值不要超过，也不要低于。 OD值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时， OD值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样。注：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。第13页/共22页 离心操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤都需快速在冰上操作，并严防污染！将达到浓度的菌液在超净台中转移到事先于-20℃预冷的离心杯中。将装有菌液的离心杯置于冰上10min，使菌液迅速冷却。第14页/共22页 2.取出冷却后的离心杯，配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4℃，离心15min。此时可以将CaCl2 溶液放入-20℃预冷（ CaCl2 溶液不要放太早，否则会冻住，冷冻结晶后的CaCl2 溶液最好弃去）。不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改。第15页/共22页 3.离心结束后，小心倒去上清，加入倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。充分悬浮细胞。4.配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4℃，离心15min，充分除去上清，加入倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。充分悬浮