《现代生物技术概论》第13章 生物信息学.pptVIP

第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 三、重组DNA导入受体细胞 （1）原核生物受体细胞 （2）真菌受体细胞 （3）植物受体细胞 （4）动物受体细胞 原核生物细胞是较理想的受体细胞类型，它具有结构简单（无细胞壁、无核膜）、易导入外源基因、繁殖快、分离目的产物容易等特点。至今被用于受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等，大肠杆菌应用的情况较多。在商品化的基因工程产品中，人胰岛素、生长素和干扰素都是通过大肠杆菌工程菌生产出来的。 真菌是低等真核生物，其基因的结构、基因的表达调控机制以及蛋白质的加工及分泌都有真核生物的机制，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优越性。常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞、曲霉菌和丝状真菌等。 植物细胞具有细胞壁，外源DNA的摄入相对于原核生物细胞较难，但经过去壁后的原生质体同样可以摄入外源DNA分子。原生质体在适宜的培养条件下再生细胞壁，继续进行细胞分裂，从植物细胞培养与转基因植株的再生两条途径都可以表达外源基因产物。另外即使没有去掉细胞壁，采用基因枪法和通过农杆菌介导法同样可以使外源基因进入植物细胞。 动物细胞作为受体细胞具有一定的特殊性。动物细胞组织培养技术要求高，大规模生产有一定难度。但动物细胞也有明显的优点： ①能够识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切加工成成熟的mRNA。 ②对来源于真核基因的表达蛋白在翻译后能够正确加工或者修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性。 ③易被重组的质粒转染，遗传稳定性好。 ④转化的细胞表达的产物分泌到培养基中，易提取纯化。 1.受体细胞的种类 第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 三、重组DNA导入受体细胞 2.重组DNA分子转化受体细胞的方法 有Ca2+诱导法 电穿孔法 三亲本杂交结合转化法 针对大肠杆菌受体细胞 叶盘转化法 基因枪法 花粉管通道法 以植物细胞作为受体细胞 第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 三、重组DNA导入受体细胞 2.重组DNA分子转化受体细胞的方法 （1）Ca2+诱导法转化大肠杆菌 制备感受态细胞 DNA分子转化感受态细胞 在LB培养基上筛选转化子 图 2-15 Ca2+诱导法促使外源DNA转化大肠杆菌的过程 第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 三、重组DNA导入受体细胞 2.重组DNA分子转化受体细胞的方法 （2）叶盘法转化植物细胞 叶盘法（leaf disc）通常用在双子叶植物细胞的基因转化上。因为最初的做法是将植物叶片切成圆盘，让工程农杆菌侵染而再生转化芽体，得名叶盘法，又称农杆菌介导法。 图2-16 叶盘法转化植物细胞的过程 第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 三、重组DNA导入受体细胞 2.重组DNA分子转化受体细胞的方法 （3）基因枪法(particle gun)转化植物细胞 于单子叶植物（农杆菌侵染较难）及特殊材料如愈伤组织、胚状体、原球茎、胚、种子等适宜采用基因枪法直接转化效果较好。基因枪法又称微弹轰击法（microprojectile bombardment或者biolistics）,其基本的原理是将外源DNA包被在微小的金粉或钨粉表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或者组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，实现基因的转化。 图2-17 基因枪的基本结构 第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 四、基因重组体的筛选与鉴定 在重组DNA分子的转化过程中，并非所有的细胞都能够导入重组DNA分子。通常我们将导入外源DNA分子后能够稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA分子的转化子称为重组子，也有将含有外源目的基因的克隆称为阳性克隆或者期望重组子。实际上真正能够转化成功的比例是较低的。若转化效率为10-6，则108个受体细胞中只有100个受体细胞被真正转化。如何使用有效的手段筛选和鉴定转化子与非转化子、重组子与非重组子成为基因转化关键的技术所在。一般情况下，能够从这些细胞中快速准确地选出期望重组子的方法是将转化扩增物稀释到一定倍数，均匀涂抹在筛选的特定固体培养基上，使之长出肉眼可以分辨的菌落，然后进入新一轮的筛选与鉴定。目前已经发展运用了一系列可靠的筛选与鉴定方法，下面介绍几种常用的技术方法。 第三节 基因工程基本技术 基因 工程 第二章 四、基因重组体的筛选与鉴定 1.载体遗传标记法 （1）抗药性筛选 图2-18 正向选择与负向选择pBR322的转化子 A．正选择系统 B. 负选择系统 这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。 第三节 基因工程基本技