钙调蛋白在临床型酮病奶牛脂解和炎症中的作用机制研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 奶牛临床型酮病是危害全球奶牛养殖健康发展的一种最重要的营养代谢病。由于奶牛 分娩前后干物质摄入减少和能量缺乏，使得机体脂解作用增强，脂肪分解产生的大量NEFA 超过肝脏氧化能力，从而引发酮病。目前，有关奶牛临床型酮病发生机制和病理学变化涉 及能量负平衡、脂肪动员、肝功异常和炎症等多个方面。并且，我们前期的临床型酮病奶 牛脂肪组织的蛋白组学研究发现，钙调蛋白（CaM ）的差异倍数是2.401 。尽管CaM 有许 多生物学功能，但是有关奶牛脂肪组织中CaM 与炎症、脂解之间的关系所知甚少。因此， 本研究提出 CaM 可能参与临床酮病奶牛脂解作用及炎症反应的假设，拟通过体内和体外 两个试验，了解CaM 对脂肪组织中脂解和炎症的调节作用，阐明CaM 在奶牛临床酮病发 生中的潜在作用机制，为丰富和发展奶牛酮病发生机制和提供防治新策略奠定基础。 试验Ⅰ ：奶牛临床酮病的血液病理学和脂肪组织中CaM、脂解和炎症的状况分析。本试 验选择12 头前胎泌乳量9 吨以上的经产荷斯坦奶牛为试验动物。根据奶牛产后14~21 d 血 中三项生化指标水平和临床表现，分为健康对照组（CON，n=6 ，BHBA1.20 mmol/L 、Glu 3.5 mmol/L、NEFA 0.7 mmol/L ）和临床酮病组（CK ，n=6 ，BHBA 3.00 mmol/L 、Glu 2.8 mmol/L 、NEFA 0.7 mmol/L ）。并且，在清晨空腹采集两组试验奶牛血清进行能量代 谢、肝功和炎症等指标的检测，尾根处采集脂肪组织进行炎症相关蛋白和脂解相关蛋白的 Western blot 和免疫组化分析。结果显示：（1）CK 奶牛血清BHBA 、NEFA 、AST 、ALT 、 IL-6、IL-1β 和TNF-α 均显著的高于CON 奶牛（P 0.0 1），而Glu 和肝脏功能指数（LFI ） 则极显著的低于CON 奶牛（P 0.01）。（2 ）CK 奶牛脂肪组织TLR4 、p-NF-κB/NF-κB 、 CaM、ATGL 和p-HSL/HSL 均显著的高于CON 奶牛（P 0.01 ），而PLIN1 则显著的低于 CON 奶牛（P 0.01 ）。（3 ）CK 奶牛脂肪组织CaM 表达量显著的高于CON 奶牛（P 0.01 ）， 脂滴较 CON 奶牛肥大，并呈现不规则形态。这些结果表明，患临床酮病奶牛不仅临床体 征明确，而且呈现出脂解增强（低血糖、高BHBA 和高NEFA ），肝功损伤（高AST 、ALT 和低LFI ）和炎症反应 （高IL-1β、IL-6 和TNF-α ）的血液临床病理学特征；同时，脂肪组 织脂解增强与 CaM 表达增高、炎症通路相关蛋白 TLR4/IKK/NF-κB 表达增高、脂解相关 蛋白ATGL 和p-HSL/HSL 表达增高以及PLIN1 表达降低有着密切的关系。 试验Ⅱ ：CaM 沉默/过表达对犊牛原代培养脂肪细胞中脂解途径和炎症通路的影响。本 实验在原代培养犊牛脂肪细胞的基础上，分别通过 si-RNA 沉默/腺病毒过表达 CaM 以及 LPS 刺激脂肪细胞的炎症模型，应用 Western blot 检测脂肪细胞中 CaM、脂解相关蛋白 I 钙调蛋白在临床型酮病奶牛脂解和炎症中的作用机制研究 （ATGL 、p-HSL/HSL 、PLIN1 ）和炎症相关通路蛋白（TLR4/IKK/NF-κB ）的表达水平。结 果显示：（1）LPS 刺激能够显著的上调脂肪细胞CaM 、TLR4、IKK、p-NF-κB/NF-κB 、ATGL 和p-HSL/HSL （P 0.01 ），下调PLIN1 （P 0.01 ）的蛋白表达。（2 ）过表达CaM 除了对 ATGL 没有显著影响外，结果与LPS 刺激一致，沉默CaM 结果与过表达CaM 相反。（3 ） 过表达 CaM 协同 LPS 刺激可以进一步上调 p-HSL/HSL （P 0.05 ）和下调 PLIN1 （P 0.01 ），还能够上调ATGL （P 0.05 ）。这些结果表明，CaM 可以经HSL 和PINL1 途径促 进脂肪细胞脂解作用，还能够