分子杂交及生物芯片技术.ppt

分子杂交技术—影响因素 离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交) 温度（低于Tm 20-25℃） 有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm 样品/探针分子的大小和复杂程度 洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针） 支持物 添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大） 第三十页，共五十六页。 # 预杂交 为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭。 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 第三十一页，共五十六页。 分子杂交技术—基本流程 样品及探针制备 样品电泳分离 转膜 预杂交 杂交 洗膜 分析（压片、显色、荧光观察等） 第三十二页，共五十六页。 分子杂交技术 Southern blot DNA提取 酶切 电泳/拍照 转膜/固定 探针制备 预杂交 杂交 洗膜 扫磷屏 第三十三页，共五十六页。 分子杂交技术 UV交联仪 多用途254nm紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上。还用于琼脂凝胶中DNA的切割，RecA突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，UV灭菌消除PCR污染。另紫外灭菌-聚合物紫外处理。 第三十四页，共五十六页。 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA多态性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD） 基因突变检测 基因copy数检测 重组子筛选 DNA指纹分析 测序 第三十五页，共五十六页。 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA指纹分析 血迹中的DNA 第三十六页，共五十六页。 分子杂交技术 Northern blot 基因表达分析 mRNA长度及半定量分析 RNA 分子（TRIzol） 甲醛变性电泳 至膜上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用10xSSC转移RNA 吸附有RNA片段的膜（亚甲蓝染色） 带有RNA片段的凝胶 第三十七页，共五十六页。 分子杂交技术 Western blot 蛋白提取/样品准备 SDS电转/丽春红S染色 封闭 一抗孵育 洗涤一抗 二抗孵育 洗膜 结果观察/显色（Dig-AP/FITC） 组织蛋白 第三十八页，共五十六页。 分子杂交技术 ISH 胚胎/组织制备固定 消化/再固定/洗涤 RNA探针制备 封闭 杂交/洗涤 一抗/洗涤 二抗/洗涤 显色(Dig-、FITC、Cy5) 抗衰老基因Klotho原位杂交图 斑马鱼krox20基因原位杂交图 3,5菱脑节 第三十九页，共五十六页。 分子杂交技术 FISH 第四十页，共五十六页。 厚德 博学 精诚 济世 分子生物学 第五章 分子杂交技术 厚德 博学 精诚 济世 分子生物学 第五章 分子杂交技术 分子杂交及生物芯片技术 申川军 广州中医药大学生物化学教研室 第一页，共五十六页。 参考书 屈伸 刘志国 第二页，共五十六页。 目 录 第一章 生物大分子制备和分析常用技术 第二章 蛋白质、核酸的提取与分离 第三章 PCR技术 第四章 分子杂交与印迹技术 第五章 分子克隆技术 第六章 外源基因转移技术 第七章 蛋白质表达技术 第八章 分子标技术 第九章 分子改造技术 第十章 测序及人工合成技术 第十一章 基因组学技术 第十二章 蛋白质组学技术 第十三章 生物芯片技术 第十四章 生物信息学技术  第三页，共五十六页。 参考书 马文丽?郑文岭?彭翼飞?? 第四页，共五十六页。 目录 第一章　核酸的分子结构与分子杂交的基本原理 第二章　核酸分子杂交的类型 　第一节　固相核酸分子杂交类型 　　一、菌落原位杂交（colonyinsituhybridization） 　　二、斑点杂交（dotblot） 　　三、southern印迹杂交（southernblot） 　　四、northern印迹杂交（northernblot） 　　五、组织原位杂交（tissueinsituhybridization） 第三章　核酸探针的种类、标记及检测 　第一节　核酸探针的种类 　　dna探针 cdna探针 rna探针 寡核苷酸探针 　第二节