RNA的甲基化修饰.pptxVIP

RNA甲基化修饰;目录; RNA甲基化修饰;早在20世纪70年代，研究者就发现了N6-甲基腺苷（m6A）修饰，m6A是能够发生在mRNA、长链非编码RNA（lncRNA）等RNA腺嘌呤（A）上的甲基化修饰。 在目前已知的171种RNA转录后修饰中，m6A是大多数真核生物mRNA和lncRNA中最丰富的修饰之一，占哺乳动物RNA中腺苷酸的0.1%-0.4%和核糖核苷酸总甲基化的50%。除了在植物和脊椎动物中存在着广泛的m6A修饰外，在单细胞生物如细菌、酵母等RNA中也发现了这种修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH（R = G或A，H = A，C或U）共有序列中，通过高通量测序发现，m6A并不是随意分布，而是在终止密码子、3′ 非翻译区（3′ UTR）、以及内部长外显子区域聚集，并且在前体mRNA中发现的更多。 类似于DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传修饰，m6A甲基化参与细胞活动中重要功能基因精细而复杂的生物学调控。越来越多的研究表明，m6A修饰参与了人类复杂疾病的发生过程，尤其在癌症的发生发展中扮演着重要的角色;N6-甲基化腺苷酸结构示意图;1、m6A甲基化转移酶（Writers）:METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492等。主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。 2、m6A去甲基化酶（Erasers）:FTO和ALKBH5等。作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。ALKBH5是一种重要的去甲基化酶，能够对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰，在N端有丙氨酸富集区和独有的卷曲螺旋结构。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。 3、m6A甲基化阅读蛋白（Readers）:YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。主要功能是识别发生 m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路 如RNA降解、miRNA加工等。YTHDF1-3 主要在胞浆中特异性识别m6A修饰的mRNA， 而YTHDC1-2的作用部位主要在细胞核内。 eIF3蛋白能够与RNA 5’端UTR上发生m6A 修饰的碱基相结合，从而促进mRNA的翻译。;1、影响mRNA前体的剪接 mRNA前体的剪接是基因表达中的重要步骤，它涉及内含子的??确切除和初级转录本外显子的连接以产生成熟的mRNA。最早提出的m6A的作用，是作为RNA剪接的调节剂。目前已有许多证据支持m6A与RNA剪接的相关性，但确切的机制尚不清楚。例如，从METTL3敲低的HepG2细胞的m6A-IP/RNA-seq数据分析显示，许多基因特别是甲基化基因显示异构体水平的差异表达，但是基因水平并无差异。同时，剪接的外显子和内含子富集m6A峰，表明m6A与mRNA的选择性剪接之间的内在联系。m6A对RNA剪接的作用可能是由于甲基化的发生会干扰剪接因子和mRNA之间的相互作用，m6A簇可能作为某些RNA结合蛋白的对接位点；或者，由于m6A使A-U碱基配的稳定性降低，RNA二级结构受到影响。;3、调控mRNA翻译 大多数m6A修饰发生在外显子，在剪接后m6A仍保留在成熟的mRNA中。因此，m6A也可以影响含该修饰mRNA的翻译。小鼠DHFR mRNA体外甲基化后用兔网织红细胞系进行体外翻译，在比较甲基化转录物的翻译水平和非甲基化转录物的翻译水平时，检测到甲基化mRNA的翻译水平增加1.5倍。当从环亮氨酸处理的细胞中纯化的细胞质转录物在体外翻译时，由甲基化mRNA产生的DHFR蛋白的量比未处理的mRNA低20％。近期，使用体外翻译以及将报告基因mRNA转染入细胞的研究显示，与未甲基化的转录物相比，腺苷甲基化导致翻译减少。因此，m6A对蛋白质生产的影响似乎在不同的mRNA中是不一致的。;5、与microRNA的关联性 MeRIP-Seq数据集的分析揭示了m6A与miRNA结合位点之间的存在着很强的相关性。67％的含有m6A峰的3’UTR也含有至少一个由TargetScan预测的miRNA结合位点。有趣的是，m6A峰和microRNA位点不重叠。通常，m6A峰在终止密码子附近是最丰富的，并且通常沿3’UTR长度推进而水平降低。而microRNA靶位点在3’UTR的末端富集。m6A在3’UTR和miRNA结合位点的存在暗示了mRNA甲基化和microRNA之间的相互作用。确定腺苷甲基化是否有助于microRNA诱导的mRNA沉默作用对于将来的研究是非常重要的。;RNA甲基化修饰的实验方法;操作：第一步对富集完的mRNA进行片段化。第二步，使用带有m6A抗体免疫磁珠与