可变剪切的分析.pptxVIP

国自然研究热点分享—— 可变剪切;目 录;; 该课题组前期发现紫杉醇可以通过调节肺癌细胞中与癌症相关的剪接事件而起到化疗药物的作用。为了系统地鉴定紫杉醇调控的剪接事件，对使用紫杉醇处理或对照的肺癌细胞进行了RNA-Seq分析。结果发现，在紫杉醇治疗后，除了基因表达发生变化外，还会出现广泛的可变剪接。而在紫杉醇治疗中这种剪接调控的机制细节在很大程度上是未知的。;材料与方法： 1、细胞培养：人肺癌A549和H1299细胞系； 2、流式细胞术分析细胞周期和凋亡 3、RT-PCR和定量RT-PCR验证 4、Western blot检测蛋白水平的表达 5、RNA测序分析 6、细胞毒试验和半抑制浓度(IC50)测定 7、克隆形成实验 8、荧光染色 9、基于RTCA的实时细胞分析;结果： 1、紫杉醇抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡：分别培养A549细胞、H1299细胞并与不同浓度的紫杉醇孵育24 h，收集细胞后用RTCA(实时细胞分析仪)和克隆形成实验进行细胞增殖和生长分析。结果表明：浓度越大时紫杉醇对细胞生长的抑制作用越强。此外，A549 和 H1299 细胞在 G2/M 期表现出剂量依赖性细胞周期停滞，以及G1期的减少，检测了A549和H1299细胞的凋亡率，发现在紫杉醇处理的最大浓度下，A549和H1299细胞的凋亡率分别达到约10%。;2、紫杉醇诱导基因表达变化的系统鉴定：为了进一步研究紫杉醇诱导的细胞生长抑制的分子机制，我们用 7.22 nM 紫杉醇处理 72 小时的 A549 细胞进行了mRNA-seq（高通量 mRNA 测序），发现了994个有显著表达变化的基因(P0.05)。在这些基因中，GADD45A、AURKA参与了DNA损伤和凋亡过程的调控。CDKN1A、AURKA、FOXM1和PLK1参与细胞周期的调控。值得注意的是，一些剪接因子也受到紫杉醇的影响，例如hnRNPUL1，这表明紫杉醇还可能通过调节RNA 可变剪接抑制癌细胞生长。 ;3、紫杉醇诱导可变剪接在肿瘤相关基因中的整体调控：系统地分析了 mRNA-seq 数据以识别差异变化的可变剪切事件后，我们获得了 855 个紫杉醇调节的可变剪接事件，其剪接百分比 (PSI) 值有明显变化（PSI 的变化 0.15，包括 552 个外显子跳跃（SE），50 个5端可变剪接（A5E） , 73 个3端可变剪接（A3E），67 个内??子保留（RI）和 113 个互斥外显子 (MXE)（图 1a）。随后的分析表明，在紫杉醇处理的细胞中，大多数可变剪接事件是负调控的(图1b)。; 利用GO分析，紫杉醇诱导的剪接事件富集在与细胞对DNA损伤刺激的反应、内质网GPI锚点的预组装、DNA模板转录、DNA修复和有丝分裂细胞周期的G2/M转变相关的组(图1c)。此外，我们进行了 STRING 分析，发现许多紫杉醇诱导的剪接目标在功能上连接成良好连接的相互作用网络，包括参与 DNA 损伤、DNA 修复和 DNA 模板依赖性转录的基因(图1d)。同时，我们进行了KEGG分析，发现紫杉醇诱导的相互作用主要集中在MAPK信号通路、T细胞受体信号通路和GPI-锚的生物合成上(图1e)。综上所述，这些结果表明紫杉醇影响的生物学过程与DNA损伤、DNA修复和细胞周期有关，这与紫杉醇对微管的作用是一致的。;4、紫杉醇诱导的选择性剪接开关：随后验证了从 mRNA-seq 结果中随机选择的六个靶点的剪接开关。正如预期的那样，我们证明了 ECT2的外显子 4 跳跃被紫杉醇显著诱导。类似地，紫杉醇处理后，ZMIZ2 外显子 8和 FMNL3 外显子 6的跳跃也升高（图 2a ）。;图 2b,2c;5、ECT2剪接开关参与紫杉醇诱导的肺癌抑制：目标是确定ECT2的短亚型（ECT2-S）在肿瘤进展中的作用，特别是在紫杉醇介导的癌症抑制中的作用。在A549和H1299细胞中稳定表达了ECT2-L和ECT2-S亚型。用紫杉醇处理细胞，发现ECT2-L主要定位于细胞核，而免疫荧光检测ECT2-S分布于细胞质和细胞核。值得注意的是，通过RTCA（实时无标记动态细胞分析技术）和克隆形成实验发现表达ECT2-S的细胞生长明显慢于对照组和表达ECT2-L的细胞(图3a，b)。这些数据表明，短异构体ECT2-S可以抑制癌细胞增殖，其作用与典型的全长ECT2相反。;随后，为研究ECT2-S是否能与紫杉醇协同抑制癌细胞生长，分别用紫杉醇处理稳定表达ECT2-L和ECT2-S的细胞24小时，通过CCK8和克隆形成实验来检测细胞活力。结果：稳定表达ECT2-S的A549/、H1299细胞与对照细胞相比可以显著抑制癌细胞的生长，而表达ECT2-L的细胞与对照细胞相比可以促进癌细胞的生长(图5