荧光定量PCR原理及操作步骤.pptxVIP

定量PCR反应体系 ①actin③achi⑤aly⑦vlg⑨stat ②actin④achi⑥aly⑧vlg⑩stat模板cDNA4ulTag mixture10ul引物10.5ul引物20.5ulH205ul1♀模板2♂模板① ③ ⑤ ⑦ ⑨443.45ng/ul686.75 ng/ul② ④ ⑥ ⑧ ⑩17.738 ng/ul26.47 ng/ul第1页/共22页第一页，共23页。 定量与常规PCR的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光第2页/共22页第二页，共23页。 PCR分四个阶段第3页/共22页第三页，共23页。 如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。第4页/共22页第四页，共23页。 定量原理确定初始模板的浓度初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量第5页/共22页第五页，共23页。 第6页/共22页第六页，共23页。 起点定量与终点定量第7页/共22页第七页，共23页。 荧光化学SYBR Green 1 TaqMan第8页/共2