ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键.docxVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
ELLMAN试剂测定自由巯基 试验鉴于的原理: 5,5-’dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收,与巯基反响后,生成2-硝基 -5-巯基苯甲酸(TNB)[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收,能够用于对肽段的自由巯基进行 定量剖析[2]。 SS  S- S S + + -OOC -OOC -OOC SH NO2 NO NO2 -OOC 2 NO 2 DTNB TNB2- 根据文件记录,TNB的吸光系数在 13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测 量的最敏捷范围在0.2-0.7之间。A=εbc,其中A为吸光度,ε是摩尔吸收光系数或消光系 数,ε单位为升/(摩尔·厘米)[L/(mol·cm)]。以吸光度下限0.2来计算(吸光系数取 14.15*103M-cm-),需要TNB的浓度为c=0.2/(14.15*103LM-cm-*1cm)=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml),需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件能够达到这个检测限度。 ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有: 1. EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系 [5]。 2. 在不同缓冲液中,TNB的最大吸收波长略微不同,所以它们在 412nm的吸收也不 3. 同,要根据选择的缓冲液来确定[5]。此外,TNB的分光光度法剖析对 SDS很敏感[6]。 4. DTNB随着pH的升高,降解速度加速。在 pH7.0,其降解速度为 0.02%/h,在 5.pH值8.0,其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高,降解速度加速,在pH12时, 15min之内会完全降解[7,8]。 6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同,随温度的升高而下降 [4]. 试验方案 主要材料: 1.材料 PEG-G-CSF 批号:080229 浓度4.32mg/ml G-CSF 批号:080126 浓度6.9mg/ml 10k超滤膜 PALL 2.试剂 SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega,lot#237826。20ug/小瓶。加入20ul50mMNH4HCO3,pH7.8溶解,配成1ug/ul的酶液。 1MDTT  刘春凤提供 TFA(三氟乙酸):TEDIA  Lot#705114 乙腈:  FisherScientificLot#055848 Starter  kit  for  MALDI-TOF  MS  :  BRUKER  DALTONICS  ,  Lot  NO 2007-208241-001(includingα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(HCCA),peptide calibrationstandard,proteincalibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ) PEG肽段反相分别流动相 A液:0.1%TFA/H2O B液:0.1%TFA/90%乙腈/H2O 3.仪器 质谱仪:BRUKERDALTONICS MALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号 KC2007-011) Beckman22R台式离心计(厂内编号 AM-039) BeckmanDU-800紫外分光光度计(厂内编号 KC2007-005) 恒温循环仪:JULABOF12-ED(厂内编号 KC2008-003) 反相柱:SymmetryC185um300à4.6*150mm,LotNO0206360111,内部编号1655 高压液相仪器:,(UV/VisibleDetector) 试验过程: 一、缓冲液替换 PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换,超滤替换缓冲液为50mMNH4HCO3,pH 7.8。使用50mMNH4HCO3作为空白比较,样品用50mMNH4HCO3稀释一倍 后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。 PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml,G-CSF的浓度约10.81mg/ml。 二、酶切办理 1)取37ulG-CSF,共400ug,加入125.5ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 取63.ulPEG-G-CSF,共400ug,加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为 2mg/ml。 2)按质量比 1:40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul,往G-CSF中加入Trypsin 10ul

文档评论(0)

178****4202 + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档