分子生物学在鱼病防治上的应用.docx

分子生物学在鱼病防治上的应用 摘要：分子生物技术在水产动物疾病诊断及预防中得到广泛应用。根据国内外研究的动向，本文对应用于水产动物疾病诊断及防治中的分子生物学技术进行了综述，阐明其原理、特点及应用，为水产动物疾病分子水平上的诊断提供参考。对限制性酶切、探针杂交和PCR诊断等方面对分子生物学在疾病诊断上的应用进行了综述，旨在为水产动物疾病的分子诊断相关研究提供参考。 关键词：分子生物学技术；水产动物疾病；分子诊断；预防； 分子生物学技术不仅在水产养殖上可以培育生长快、抗寒、抗病的新品种，而且在水产动物疾病诊断上亦可显示其独有的优势。传统的鱼病诊断主要依据肉眼观察、症状判别、显微境检查、微生物培养、表型分析、血清学分析、病理切片观察等，这些方法的诊断时程较长。而水产动物发病迅速，由于不能及时治疗而给生产造成重大损失。如鱼发病时，由于诊断结果尚未得出，人们往往大量使用氯制剂、硫酸铜和孔雀石绿等药物先行治疗，结果由于残毒影响，很难生产出健康的水产品。分子生物学技术的诞生，使水产动物疾病快速而直接的分子诊断得以实现。分子生物学技术在鱼病诊断上的应用，显示了其强大的优势，可以为微生物病原体的鉴定提供直接的方法，不仅可以鉴定特定病原种类，也可以鉴定和区分出不同的品系和亚种；不仅可以鉴定微生物鱼病，也可以鉴定寄生虫鱼病。通过病原体遗传物质DNA的扩增诊断水产动物疾病，可极大提高诊断的特异性和灵敏度；可缩短诊断的时程，使水产动物疾病诊断方式发生根本性的变革，大有替代传统诊断方法的趋势。目前在水产动物疾病诊断上常用的分子生物学方法有限制性酶切、探针杂交和PCR等，笔者对此进行了综述，以期为水产动物疾病的分子诊断提供指导。 分子生物学技术在水产养殖动物疾病诊断中的应用 1.1 限制性酶切(Restrictionenzy medigestion)检测 限制性酶可识别DNA上较短的序列，在识别位点上切开DNA，单个核苷酸变化即可导致限制性酶切位点的增加或缺失。因此，酶切后产生的片段数目发生了改变，即所谓的限制性片段长度多态性。然后进行凝胶电泳，酶切后的DNA片段根据大小在凝胶电泳上进行分离，染色后即可观察各个不同的片段，进行遗传变异的分析。不同样品总DNA酶切后即可产生限制性酶切多态性。然而检测这些多态性差异，需要使用标记的特异DNA探针加以确定。同位素标记通过放射自显影显示，非同位素标记(如酶标记等)可通过显色技术显示，从而揭示DNA的多态性。另一种方法可以不需要DNA探针杂交，而首先对DNA段进行限制性酶切，然后靶定DNA特定片段，通过PCR扩增显示限制性片段多态性，即所谓的扩增片段长度多态性(AFLP)。这种诊断对于病原微生物是相当有用而直接的方法。也可以鉴别特定的寄生虫。Chang等从美国3个不同的海岸水体(NewYork、NewJersey、Texas)收集的蓝蟹，通过PCR和原位杂交分析两步诊断证实存在白斑综合症病毒。通过RFLP方法，对于一个1156bp片段的WSSVrrl-specificRsaI进行扩增，从而区别NewJersey蓝蟹WSSV和其他地方分离的WSSV。1.2 探针杂交(Probes hybridization)检测 特异性的核酸探针杂交是鉴定病原体十分有效的方法，探针可用于检测和确定病原体特定序列，甚至可检测被其他核苷酸片段污染的样品。但探针的设计及杂交的条件要求严格，主要目的是确保探针和样品中互补核酸序列特异性结合。对关于核酸探针的标记和检测系统的多样性进行了综述。目前常用的标记有半抗原(如生物素或地高辛)标记和荧光标记。标记和检测方法的多样性能够提供适宜的系统进行点印迹或原位杂交。限制性酶切后，可以用探针确定和检测片段，尤其在多种片段混合物存在的情况下，通过探针和随后凝胶电泳确定片段的相对位置，可以鉴定样品。组织切片也可运用原位杂交探针，用以检测病原体在组织和细胞内的定位。在对特定病原进行大规模调查时，这种方法的运用具有较大的优点。也可以设计适当的探针检测鱼类、贝类和虾蟹类原生动物寄生虫。Venkate swaran等使用了旋转酶B基因(gyraseB，gyrB)作为分子诊断探针。可以在用病毒(Vibrio.Parahaemolyticus)人工接种的27个虾样本中测到病毒。对于虾中V.parahae molyticus病毒的检测提供了一个快速、可靠、灵敏的方法。Mari等从纯化的TSV(Taura Syndrome Virus)提取ssRNA基因，转录成双链cDNA并且被用来构建cDNA文库。然后通过载体和质粒重组的方法筛选两个特异性的pP15和pQ1探针，通过Northernbloting和dotbloting，两个探针能够特异性地与提取的RNA-TSV基因、TSV和感染TSV的虾组织匀浆液进行杂交。