CRISPR protocol-Cas9介导的同源重组.pdfVIP

Cas9 介导的同源重组 Cas9 介导同源重组 （HDR）的基本操作和做基因敲除（KO）基本一致（Fig 1），除了需 要多引入一条修复模板（repair template）。顺利的情况下整套操作下来至少需要4 周时间 （心急吃不到热豆腐嘞~~），其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤 （小伙伴在这一步 可以开开脑洞优化一下）。 WT 的Cas9 （这里指spCas9）是引起双链断裂（DSB），进而引起NHEJ （nonhomologous end joining，意思就是断裂的末端重新连起来，这一过程容易产生indels）或者HDR （修 复模板存在）；但有一个突变体（D10A）却只保留了切口酶的活性（nickase） （spCas9n）， 一般不会引起NHEJ，但会引起HDR （修复模板存在）。大家周知WT 的spCas9 会有些微的脱 靶效应，因此利用cas9n 代替WT 的cas9 产生deletion （需要两条sgRNA 同时作用）或者 HDR 可以降低一部分脱靶的效果 （Fig. 2）。 Fig 1. Cas9 敲除/敲入基因时间安排(1)。 汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092- 地址：上海市浦东新区蔡伦路150 号1 号楼2 楼 021- 邮箱：service@ Fig 2. Cas9 (D10A)突变体（Cas9n）只保留nickase 活性。这一突变体不会引起NHJE。 如果同有两条sgRNA 靶向一个gene 的不同位点，Cas9n 会引起一个片段（两个sgRNA 之间） 的deletion。修复模板存在的情况下可以引起HDR (1)。 今天的内容主要讲讲利用Cas9 怎么做同源重组（修复）（HDR）。其实基因的敲入（KI） 也是一模一样的做法。 一、 同源臂的设计：和做KO 比较，做HDR 最大的不同就是要有同源模板的存 在。同源模板有以下两种类型(Fig. 3): 1. 单链模板：手动设计单侧同源臂长度不低于 40 nt，但强烈推荐设计~90 nt。 找引物合成公司合成较长单连oligo 即可(90+90+Insertion)，针对正链或者反链合成 都ok。没有必要使用PAGE 纯化。为了验证方便，建议引入酶切位点（RFLP 法）。当然， 同源模板也可以是线性化的双链DNA 片段，可以通过线性化载体或者基因合成/PCR 获 得。溶解成终浓度10 M，-20C 分装保存。 2. 线性化双链模板：同源臂在1000 nt 左右；线性化载体或者PCR 产物作为转染 模板； 二、 转染： 5 12-孔板：~210 cells/well (50-70% confluency) 汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092- 地址：上海市浦东新区蔡伦路150 号1 号楼2 楼 021- 邮箱：service@ 500 ng Cas9 （或者Cas9n）-sgRNA 1 l 单链同源模板 （10 M） 三、 鉴定方法： 通过 GFP 或者 puromycin 富集成 mixture ，然后直接 PCR 测序或者利用 Restriction-fragment length polymorphism (RFLP) 分析方法. 四、 结论： 1. WT 的Cas9 直接切割双链，引起DSB，重组效果最好，但会引起脱靶； 2. 单链oligo 作为模板优于线性化载体作为模板； 3. 貌似反义 oligo 的模板效果优于正链。 Fig 3. Cas9 介导同源重组(1) 五、 多说几句 目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系 （包括ES 细胞等）/受精卵 （Zygote