植酸酶活性测定.docVIP

第 PAGE 4 页 共 NUMPAGES 4 页 饲用植酸酶活性的测定 分光光度法 范围 本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。??? 本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U／kg。 2? 引用标准??? 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。??? GB／T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987) 3? 植酸酶活性单位定义??? 样品在植酸钠浓度为5.0 mmol／L、温度37℃、PH值5.00的条件下，每分钟从植酸 4? 方法原理??? 植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。 5? 试剂和溶液??? 本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB／T 6682中规定的三级水。??? 清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。5.1 0.25mol／L 乙酸缓冲液(I) 称取34.02g三水乙酸钠于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。5.2? 0.25mol／L乙酸缓冲液( 称取34.02g三水乙酸钠，0.5g TritonX-100,0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。5.3? 7.5mmol/L植酸钠溶液 c(C6H6O24P6Na 称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL。容量瓶中，用0.25mol／L乙酸缓冲液(5.1)溶解并定容至刻度，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol／L)。5.4? 硝酸溶液：1+2水溶液。5.5? 100g／L钼酸铵溶液 称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。容量瓶中，加入1.0mL氨水(25％)用水溶解定容至刻度。5.6? 2.35 g／L 称取0.235 g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(5.4)，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。 移取2份硝酸溶液(5.4)，1份钼酸铵溶液(5.5)，1份钒酸铵溶液(5. 6)混合后使用，现用现配。(注意：不要有白色乳状沉淀，加硝酸要慢)5.8? 植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。5.9? 磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物。 6? 仪器和设备6.1? 实验室常用仪器设备。6.2? 恒温水浴：(37±0.1)℃。6.3? 分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。6.4? 磁力搅拌器。6.5? 涡流式混合器。6.6? 酸度计：精确至小数点后2位。6.7? 离心机：转速为4000r／min以上。 7? 试样制备??? 取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0. 8? 测定步骤8.1? 绝对法(仲裁法)8.1.1? 标准曲线??? 准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.9)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.2)溶解，并 标准序号 稀释量／mL 浓度／(mmol／L) 1 0.5→1 25 2 0.5→2 12.5 3 0.5→4 6.25 4 0.5→8 3.125 5 0.5→16 1.562 5 8.1.2? 试样溶液的制备??? 按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001 g，置于100 mL容量瓶中，加入约70mL乙酸缓冲液(5.2)﹡，一个磁力棒，在磁力搅拌器(6.4)上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(5.2)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机(6.7)上以4 000r／min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(5.2)稀释（一般取2ml上清夜到50ml容量瓶中），使样液浓度保持在0.4U／mL。左右，待反应。??? 建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。 ﹡以玉米芯、麸皮等为载体时可提高缓冲液5.2中TritonX-100及BSA的浓度至0.5%8.1.3?