基因克隆的质粒载体.pptVIP

iv）链霉素（Streptomycin，Str） a）杀菌原理 通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。 b）细菌抗性原理 Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。 第六十二页，共一百零三页，2022年，8月28日 v）四环素（Tetracycline，Tet） b）细菌抗性原理 a）抑菌原理 通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。 Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。 第六十三页，共一百零三页，2022年，8月28日 第六十四页，共一百零三页，2022年，8月28日 第六十五页，共一百零三页，2022年，8月28日 ② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。 第六十六页，共一百零三页，2022年，8月28日 第六十七页，共一百零三页，2022年，8月28日 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。 （2）抗菌素选择原理 活 死 抗性基因 抗菌素 第六十八页，共一百零三页，2022年，8月28日 4. 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体 ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。 第六十九页，共一百零三页，2022年，8月28日 （2）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途: 由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。 pLG338、pLG339、pHSG415等 不适合大量扩增DNA用。 适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。 第七十页，共一百零三页，2022年，8月28日 （3）失控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。 温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。 1979年B. E. Uhlin等构建。如pBEU1、pBEU2。 在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。 第七十一页，共一百零三页，2022年，8月28日 （4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。 如pDF41、pDF42、pBR329。 抗菌素抗性 外源DNA 无抗菌素抗性 选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。 第七十二页，共一百零三页，2022年，8月28日 （5）正选择的质粒载体(Direct selection vectors) 如pUR2、pTR262等。 只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。 具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。 目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。 第七十三页，共一百零三页，2022年，8月28日 4 质粒DNA的复制类型 1.低拷贝数的质粒 拷贝数少，只有1—3份拷贝，也称为“严紧型”复制控制的质粒（stringent plasmid） 2. 高拷贝的质粒 拷贝数多，有10—60份拷贝，也称为“松弛型”复制控制的质粒（relaxed plasmid） （非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。 根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，将质粒分为低拷贝数的质粒和高拷贝数的质粒 第三十页，共一百零三页，2022年，8月28日 质粒拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目。 质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型间存在一定的相关性。 接合型质粒，分子量大，一般属严紧型 非接合型质粒分子量小，一般属松弛型 第三十一页，共一百零三页，2022年，8月28日 第三十二页，共一百零三页，2022年，8月28日 （1）质粒的不亲和性现象　　 所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切