RNA在病原微生物检测中的应用.ppt

RNA在病原微生物检测中的应用 2021/3/29 星期一1 摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结2021/3/29 星期一2 摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结2021/3/29 星期一3 病原体检测方法分类以看到“整个病原体”为基础的方法镜检，培养以直接或间接看到“病原体组分－蛋白质”为基础的方法免疫学胶体金，Elisa, 化学发光，etc以看到“病原体组分－核酸”为基础的方法 分子生物学2021/3/29 星期一4 分子诊断概念和特点概念：利用标本中的核酸作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判断的方法。特点：特异性高、灵敏度高诊断范围广、适应性强2021/3/29 星期一5 什么是核酸？链状分子DNA (脱氧核糖核酸) 贮存遗传信息RNA (核糖核酸) 传递遗传信息遗传信息的传递途径DNARNA蛋白质转录逆转录2021/3/29 星期一6 DNA vs. RNA（一）DNA是双螺旋结构，RNA是单链结构DNA很稳定，RNA很不稳定2021/3/29 星期一7 DNA vs. RNA（二）有些RNA在细胞中拷贝数很多一个或几个拷贝DNA104核糖体RNA (rRNA)16S rRNA23S rRNA使用rRNA为靶标，可以大大提高了取样效率和检测灵敏度。2021/3/29 星期一8 常见的RNA检测技术NASBA（国外）TMA（国外）SAT（国内）2021/3/29 星期一9 SAT技术原理①②③④同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝。然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况；同时，每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。?2021/3/29 星期一10 SAT与PCR技术原理比较RTRNAcDNART~1000 copiesT7SATDNATaqTaq PCR30分钟内扩增1010倍RNADNA2021/3/29 星期一11 SAT配套仪器(全自动工作站)样本---提取纯化RNA--- 酶反应混合液（一体化）全封闭生物安全性好快（48个样本/2.5小时）2021/3/29 星期一12 摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结2021/3/29 星期一13 DNA用于临床检验的不足“死菌检测也阳性”，与临床相关性差 基因型与表型不吻合 (耐药检测) 不能区分“潜伏感染”“活动性感性” 易交叉污染 反应易受抑制2021/3/29 星期一14 SAT检测靶标为16SrRNA灵敏度更高 RNA在细胞中拷贝数很多，细菌中16s rRNA多达10000-20000个一个或几个拷贝DNA104 16s rRNA2021/3/29 星期一15 Jensen, 1994- 16SrRNA具有高度保守性 不同来源MG的16SrRNA区域，PCR产物序列同源性100%，准确区别不同病原体SAT检测靶标为16SrRNA检测特异性高2021/3/29 星期一16 16SrRNA长度适中，适合做探针，检测更准确其编码基因长度约为1500bp, 包含50个左右功能域2021/3/29 星期一17 RNA诊断（TMA、SAT）具有非常高的灵敏度和准确度Gen-probe: RNA检测罗氏:DNA检测2021/3/29 星期一18 与DNA相比，RNA检测更利于疗效评估及判愈DNA双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有“死菌”残留，人体内完全代谢需2-3周时间 中国性病诊疗指南中指出，如用PCR方法进行判愈，需在疗程结束后3-4周。RNA单链结构，易降解，病原体死亡后2-3天后完全降解 与临床相关性好，=“培养” ，有利于疗效评估和及时判愈 有些情况下，可以直接诊断“活动性感染” 活动性感染：指示RNA转录活跃 潜伏感染：指示RNA不转录2021/3/29 星期一19 能检测多种样本类型，比如尿液等，取样方便。数据来源：M. Chernesky, D. Jang, K. Luinstra, et al. 2006. High Analytical Sensitivity and Low Rates of Inhibition May Contribute to Detection of Chlamydia trachomatis in Sign