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质粒载体的构建 摘 要：质粒载体的构建。首先要获得目的 DNA 。根据其目的 基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次 PCR 的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切 位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到 T-DNA 上 ， 再 利 用 电转 化 的 方 法 将 连 接 产 物 转 化 到 带 有 PCAMBIA1381 的DH5 α感受态细胞中复制表达。 关键词： 质粒 DNA PCR 电泳 感受态 转化 1. 引言 质粒（plasmid ）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的 遗传成分。其特点如下： ① 是染色质外的双链共价闭合环形 DNA （cccDNA ），可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在 2-300kb 之间，＜15kb 的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb 的大质粒则不易 提取。 ② 能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA 复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 ③ 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合 成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药 性质粒，又称 R 质粒，带有R 质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体 都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改 造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。 质粒载体 pBR322 是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载 体之一。符号质粒载体 pBR322 中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者 Bolivar和 Rogigerus 姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体 pBR322 的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。 优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行 使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三 个优点。 质粒载体 pBR322 的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后， 每个细胞中可累积 1000-3000 份拷贝，该特性为重组体 DNA 的制备提供了极 大的方便。 构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯 化和扩增特定 DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入 克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得 到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到 插入 DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1 目的DNA 的获得 2.1.1 引物设计 第一次引物设计： 正向引物： sinn3F 冰盒标注：P 2a 引物序列：5 ’— AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3 ’ 引物长度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒标注：P 2b 引物序列：5 ’— GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3 ’ 引物长度：22bp 第二次引物设计（带酶切位点）： 正向引物： sinn3FE 冰盒标注：P 2c 引物序列： 5 ’— ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3 ’ 引物长度：34bp 反向引物：sinn3RE 冰盒标注：P