第二三章转基因食品生物技术详解演示文稿.pptVIP

电泳目的：对核酸分子进行分离和检测 影响电泳迁移率的因素 分子的大小：小则快 带电荷数：多则快（不同DNA 分子片段电荷大致相等） 不同的DNA片段的电泳迁移率 主要取决于分子的大小! 现在是95页\一共有157页\编辑于星期四 凝胶浓度: 浓度 大 ，筛孔小，适合 小 分子电泳； 浓度 小 ，筛孔大，适合 大 分子电泳 ? 凝胶分辨DNA的能力： 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 浓度 分辨范围(kb) 浓度 分辨范围(bbp) 0.3% 5-60 0.6% 1-20 0.7% 0.8-10 0.9% 0.5-7 1.2% 0.4-6 3.5 1000-2000 5 90-500 8.0 60-400 12 40-200 15 25-160 1.5% 0.2-3 20 6-100 原来如 此！ 凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小 现在是96页\一共有157页\编辑于星期四 2、基因表达载体的构建 使目的基因稳定存在并遗传 一个基因表达载体包括： （最核心步骤） 使目的基因表达和发挥作用 启动子 ——RNA聚合酶的识别和结合位点， 驱动基因转录 目的基因——使受体生物表现出更符合人类 需求的性状 终止子 ——结束转录 标记基因——鉴别筛选出含目的基因的受体细胞 其他 如复制原点、运载体上原有的基因 现在是97页\一共有157页\编辑于星期四 DNA重组技术基本步骤 ? 1.分离获得目的基因； 2. 在 体 外 进 行DNA 重 组 ， 将 外 源DNA 连接到能自我复制又带有选择标记的载 体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 44. 筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆 ； 现在是98页\一共有157页\编辑于星期四 目的基因制备和载体系统 目 的 基 因 来 源 ： 基 因 组DNA 分 离 、 化 学 合 成 、PCR 扩 增 、cDNA 文 库 及DNA 文库中制得。 载体：质粒 、 λ噬菌体 、 柯氏质粒 、 YAC载体 等 工具酶：限制性内切酶、连接酶、 DNA聚合酶 等 现在是99页\一共有157页\编辑于星期四 一、DNA重组技术相关概念 克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞 或动物（常被成为副本或拷贝）。 克隆化(cloning) 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。 现在是100页\一共有157页\编辑于星期四 DNA克隆 (DNA cloning) 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。 继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有 目的基因的转化子细胞。 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又 称基因克隆(gene cloning) 或分子克隆(molecular cloing)。 现在是101页\一共有157页\编辑于星期四 “克隆”某一基因或 DNA片段过程中， 将外源 DNA插入载体分子所形成的复制子 是杂合分子－嵌合 DNA，所以 DNA克隆 又 称 重组 DNA (recombinant DNA)。 实现 DNA克隆所用的方法及相关的工 作称 DNA重组技术 (recombinant DNA technology)，又称 基因工程 (genetic engineering)。 现在是102页\一共有157页\编辑于星期四 二、DNA重组技术基本程序 外源 DNA的获取 克隆载体的选择与构建 目的基因与载体的连接 DNA导入受体 菌 重组体的筛选 克隆基因的表达 现在是103页\一共有157页\编辑于星期四 三、DNA重组的基本步骤 + 连接 载体 目的基因 + 转化、筛选和鉴定阳性克隆 克隆基因表达 含重组子的阳性克隆 分、切、接、转、筛 现在是104页\一共有157页\编辑于星期四 目的基因的载体连接 --接， 重组DNA技术核心 现在是105页\一共有157页\编辑于星期四 二、外源DNA片段和载体的连接 （一）粘性末端连接法 适用于插 入片段和 质粒 载体具有 相同的粘 性末端 单 酶 目的基因 用同一种 限制性内切酶酶切 酶 切 DNA连接酶 重组质粒 缺陷 高背景(自身环化) 双向(正、反)插入 多拷贝插入 现在是106页\一共有157页\编辑于星期四 （二）平头末端连接法 质粒