细胞复苏实验步骤及注意事项.docxVIP

— — PAGE 1 — 细胞复苏实验步骤及注意事项 细胞复苏是与细胞冻存的过程相反，是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构和生化反应恢复正常水平。与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活率。实验材料基础培养基血清（常规为FBS/NBS）电动移液枪移液枪移液管[NEST]无冰冰盒[NEST]T25培养瓶[NEST]自动旋盖机[NEST]盒装无菌吸头[NEST]100mm细胞培养皿[NEST]15mL、50mL无菌离心管[NEST]01不能忘记的准备1.记得一定要预定干冰！！！不然你细胞取出来可没地方待了，要是液氮罐距离实验室远点，你的细胞可能就没了。2.用来转移细胞的无冰冰盒一定要灭菌！！！当然，如果条件刻苦点的泡沫盒，也不要偷懒，无论什么装载容器，都要提前灭菌，可以有效规避污染风险。3.水浴锅提前预热至37℃。4.培养基预热至37℃。02要开始了！（敲黑板）1.在生物样本库中搜寻到目标细胞,在液氮罐找到对应的细胞，放入预先准备好的无冰冰盒（容器）内。冰盒内装有碎干冰，冰芯的铝合金外壳协同高导热的合金模块，确保样品能快速冷却，孔之间的温度差异小于0.1℃，能很好的维持样品间的温度一致性。2.在细胞进入水浴锅解冻前，务必将冻存管竖直立在桌面上10~20s，这样之后，可以排空可能存在在冻存管盖缝隙内的液氮。尤其是外旋盖的冻存管，特别要注意！不然在水浴解冻的时候有概率会砰的一声爆发出来！极为危险。3.将冻存管在37℃水浴锅内水浴解冻，因为DMSO在常温情况下对细胞有毒副作用，若解冻时间过长，会导致细胞损伤并影响其存活率，所以一定要快，解冻过程在1~2min内完成。4.解冻完成后，在生物安全柜内，用自动旋盖机打开冻存管，之后在移液枪将冻存管内细胞复悬，然后将细胞悬液转移至含有5~10ml培养基的离心管中，1000rmp离心5min（根据各自细胞的特新调整离心力和离心时间）。如果没有培养基稀释，在离心过程中较高浓度的DMSO会对细胞损伤，影响细胞存活率！5.丢弃上清，里面还有DMSO和死去细胞的裂解产物，这不是我们所需要的。将剩余的细胞用培养基稀释复悬，稀释比例为1:10~1:15，再按照大家各自实验需求，分装到100mm培养皿或者T25瓶中，显微镜观察细胞状态，然后转移至细胞培养箱中培养。03复苏后的注意点复苏后记得每天都要观察细胞状态，及时更换培养基，确保细胞所需营养的充足和生长环境的清洁。附：可使用到的耐思产品 移液管  无冰冰盒 T25培养瓶 盒装无菌吸头 100mm细胞培养皿 15mL、50mL无菌离心管