细胞计数仪进行细胞计数实验的步骤和方法.docxVIP

— — PAGE 1 — 细胞计数仪进行细胞计数实验的步骤和方法 细胞计数是确定培养中铺板的细胞浓度、确定细胞活力和评估细胞分离程序结果的一个组成部分。建议在细胞分离之前进行初始细胞计数；然后可以将该数字与细胞分离后的细胞计数进行比较，以计算细胞恢复率。此外，当预期细胞活力可能会降低时，应进行活细胞计数，例如，在处理冷冻保存的细胞或离体操作的细胞时。本文描述了如何使用3%乙酸和亚-CH3蓝进行总有核细胞计数，以及如何通过台盼蓝染料排除进行活细胞计数。实验步骤和方法：I部分：样品制备选项1：用3%乙酸和亚-CH3蓝对总有核细胞计数进行细胞稀释使用磷酸盐缓冲盐水或无血清培养基对充分混合的单细胞悬浮液进行适当稀释。为了准确表示浓度，请使用至少20L的细胞悬浮液进行稀释。示例：制备10倍稀释液在微量离心管或96孔板的孔中加入180L的3%乙酸和亚-CH3蓝。混合细胞悬浮液，将20L添加到含有3%乙酸和亚-CH3蓝的试管或孔中。选项2：通过台盼蓝染料排除对活细胞计数进行细胞稀释确保要计数的细胞悬浮液*重新悬浮。在细胞沉降之前，将适量的细胞悬液(20-200L)放入离心管中。加入等体积的0.4%台盼蓝并轻轻混合。将混合物在室温(15C25C)下孵育5分钟。II部分：使用血细胞计数器进行细胞计数通过用70%C2H6O清洁腔室表面来制备血细胞计数器。擦干。将盖玻片放在腔室上。使用20L移液器重新悬浮细胞混合物，并将10L的染色细胞放入血细胞计室。注意：小心不要移动盖玻片。允许毛细作用将样品吸入。将血细胞计数器放在双目光学显微镜的载物台上。将显微镜调整到10倍放大倍率并聚焦在细胞上。使用手动计数计数器，计算血细胞计数器四个外部正方形中的每一个中的细胞（染色的细胞核）（图1A），包括位于底部和左侧周边的细胞，但不包括位于顶部和右手边（图1B）。如果在第一部分中使用了3%乙酸和亚-CH3蓝，则计算染色的细胞核。如果在第一部分中使用了台盼蓝，则计算未染色的活细胞。细胞计数仪血细胞计数器图指示（A）四组红色和（B）其中一组应用于计数的16个方块。注意：适当的稀释系数将取决于起始样本中存在的大致细胞数量，但应使血细胞计数器中的细胞浓度为每平方（即大或主要正方形）50-100个细胞。如果血细胞计数器上每个主要正方形的细胞多于或少于大约100个，请使用更大或更小的稀释因子制备新的稀释样品。血细胞计数器的九个主要方块中的每一个都代表0.1mm3的总体积。由于1cm3相当于1mL，因此可以使用以下等式确定细胞浓度：有核细胞总数/mL=每平方平均细胞数x稀释因子x104示例：如果四个外部方块中的每一个的细胞计数在100稀释因子下分别为21、15、20和17，则平均细胞计数将为(21+15+20+17)4=18.25。因此，原始悬浮液中细胞的总浓度为：18.25x100x10^4=18,250,000个细胞/mL。使用人工的细胞计数方法误差率较高，为提高细胞计数的准确度和细胞计数效率可以使用细胞计数仪进行细胞计数。博大博聚旗下的细胞计数仪系列，具有多种规格供选择，可以满足不同的用户需求。