小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞定株简要流程.docxVIP

— — PAGE 1 — 小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞定株简要流程 实验材料：DMEM高糖培养基 FBS/NBSHT选择培养基 CO2细胞培养箱细胞计数器 单通道移液枪、多通道移液枪相差显微镜 生物安全柜10L、200L、1000L吸头 [NEST]96/24/6孔细胞培养板 [NEST]15mL、50mL无菌离心管 [NEST]100mm细胞培养皿 [NEST]T75细胞培养瓶 [NEST]96孔酶标板 [NEST]实验准备：阳性对照：融合前采对应实验的小鼠眼球血，37℃放置2h，然后4℃放置2h，最后10000rpm离心10min，取上清，-20℃条件下保存。（使用前提前解冻，稀释1000倍备用）阴性对照：各个阶段培养基留5ml左右，作为阴性对照用。Elisa检测板准备：将对应抗原用CB以1g/ml浓度加入96孔酶标板内（100l/孔），4℃过夜静置包被。用1PBST洗板2遍，清洗结束，加入封闭液封闭，37℃封闭1h，用1PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存，-20℃长期保存。实验流程融合检测：细胞融合换液后，等4~7天，观察细胞融合状态，大部分细胞培养孔内出现小细胞团，即可开始检测。用排枪取融合培养上清100L/孔至包被好的Elisa检测板中，因为Elisa检测板来源于外部，切记从细胞培养板中单次取液，不可反复吸取，取一次液换一次枪头，防止污染细胞培养板内细胞，以及交叉污染影响检测结果。（每块板预留一孔阳性对照孔，一孔阴性培养基对照孔）根据阴性对照和阳性对照的OD值，确定阳性孔，取阳性对照OD值得一半以上的数值为阳性。第一次亚克隆：根据融合检测的数据，挑选阳性孔，将阳性孔中的细胞转移至24孔板中培养扩增，根据细胞生长情况2~3天后采用Elisa方法复检，防止假阳性。挑选24孔板中复检阳性的孔，进行细胞复悬，使细胞在培养基中分散均匀。用细胞计数板进行计数，计数完成后，根据计数情况比例稀释细胞悬液，按照1个/孔的密度均匀铺于96孔细胞培养板中，一个阳性克隆株铺一块细胞培养板板。[一次亚克隆采用FBS-DMEM(HT),培养基的血清使用浓度略低于融合时的浓度，略高于SP2/0常规培养浓度，可按照5%进行区分]画克隆：一次亚克隆后，融合细胞在CO2培养箱中培养4~5天后，采用相差显微镜逐孔观察，在单孔内有且只有一个正圆形细胞团的孔，即为单克隆细胞孔，做好标记。若无无单克隆孔，则挑选细胞团较少的多克隆细胞孔，做好标记。一次亚克隆检测：画克隆后，继续培养3~5天，根据细胞生长情况，采用Elisa法进行一次亚克隆检测，优选挑选阳性单克隆孔，若无阳性单克隆孔，则挑选克隆数较少的阳性多克隆孔。挑选出来的细胞株转移至24孔扩增培养，进行阳性克隆株复筛，确保挑选的细胞株非假阳性。二次亚克隆：将一次亚克隆挑选出来的细胞株，重复一次亚克隆步骤。细胞培养基换成FBS-DMEM，培养基的血清使用浓度调整成SP2/0的常规培养浓度。画克隆二次亚克隆后4~5天，进行画克隆，单克隆孔做好标记。二次亚克隆检测：画克隆后，继续培养3~5天，重复一次亚克隆检测步骤，挑选阳性单克隆细胞株，准备进行扩增培养。建株：阳性单克隆细胞株需进行至少2次的亚克隆，检测为全阳方可建株！若为了保证稳定性，建议进行第三次亚克隆。挑出两次检测均为单克隆且全为阳性后，在24孔板中培养扩增，2~3天后用Elisa法进行交叉检测（主要针对带标签的蛋白抗原）和稳定性鉴定。检测合格后挑选一个细胞状态，长势较好且阳性OD值较高的细胞株，转移至6孔板进行培养扩增，2~3天后，用亚型检测试剂盒进行抗体亚型鉴定。完成以上鉴定后，将单克隆细胞株转移至100m细胞培养皿或者T75细胞培养瓶中进行大量扩增。扩增完成后将单克隆细胞株进行细胞冻存，标记好细胞名称、冻存者、冻存日期等信息，放置冻存盒中，转移到-80℃冰箱，一天后转移至液氮罐中储存。冻存后一周再复苏检测，防止细胞株出现产抗不稳定现象，若检测没有问题，则将细胞株录入细胞库中，并撰写实验报告。（细胞冻存3支/株，且3支确保有2个及以上冻存批次，避免出现冻存失误，细胞株丢失）使用到的NEST产品：10L、200L、1000L吸头 [NEST]96/24/6孔细胞培养板 [NEST]15mL、50mL无菌离心管 [NEST]100mm细胞培养皿 [NEST]T75细胞培养瓶