鸡神经病靶酯要点.pptxVIP

Company L鸡神经病靶酯要点第1页/共22页 成年鸡神经病靶酯酶的同一性和特征描述第2页/共22页 Contents小结实验结果所选用的材料与方法文章的主要内容总结文章出处及作者简介第3页/共22页 文章出处及作者简介文章出处：GENE 2009.01作者及其简介：常平安，伍一军等伍一军，男，安徽桐城人。佐治亚医学院分子医学与遗传学系基因调控专业博士后，现任中国科学院动物学研究所研究员，中科院研究生院教授，博士研究生导师。主持分子毒理学实验室，专业方向为分子毒理学，主要研究领域为神经毒理学、环境毒理学以及药物引起的神经疾病。主要研究兴趣在于环境有害化学物质的神经毒性机制；神经病靶标酯酶引发迟发性神经毒性的分子机理； 第4页/共22页 文章的主要内容总结这篇文章主要讲NTE的基因排序。NTE的基因中的活性部位。NTE的基因中不同部位被GFP标记后主要在哺乳动物中的分布。GFP标记的cNTER可以被macroautophagy和蛋白酶体这两种东西破坏，而导致其含量下降。第5页/共22页 NTE的概念及其基本特点　 神经病变靶标酯酶(neuropathy target esterase ,NTE)是在研究有机磷化合物引起的迟发性神经病变(organophosphate2induced delayed neuropathy ,OPIDN) 的发生机制过程中发现的。通常认为NTE 的抑制和“老化”是OPIDN 发生的前提[。NTE 是一个由1 327个氨基酸组成的跨膜蛋白。将不同的NTE 肽段在大肠杆菌中重组表达,发现具有有机磷敏感性和戊酸苯酯水解活性的重组多肽至少含有727-1216 氨基酸序列,这一重组多肽被称为NTE 酯酶活力域(NTE esterasedomain ,NEST) 。以往的研究结果提示,NTE 除了具有酯酶活力外,NEST在神经细胞分化和神经系统发育中起着重要作用 。NTE不仅存在于脑、脊髓和周围神经，在外周淋巴细胞内含量也很高。第6页/共22页 所选用的材料与方法成年鸡及各个实验用的一些基本试剂。1.分子克隆鸡NTE基因的调控序列。2.鸡NTE序列的扩展和延伸。3.质粒的构建4.细胞培养和转染5.给细胞施加MG132,AC,3-MA,雷帕霉素等处理因素。6.Western blotting分析。7.NTE活性检8.共聚焦显微镜测定简介第7页/共22页 实验结果第8页/共22页 鸡的完整的NTE序列是4501bp组成 （base pair kilo-base pair DNA碱基对数目生物学上描述DNA常用的kb、nt、bp kb=千碱基对 kilobase nt＝核苷酸 nucleotide bp＝碱基对 base pair ）鸡的NTE有两个不同的区域，其中一个是推定的调节区（cNTER）,另外一个是催化区，也叫NTE酶的活性区域 序列分析表明，鸡的NTE的排列与人和鼠的NTE排列有高度的相似性，其中与人有80%的相似性，与鼠有79%的相似性。第9页/共22页 实验结果二，cNEST是有NTE活性的，而不是cNTER是用细胞转染的方法来证明的。就是用GFP来标记cNEST和cNTER的羧基端，48h的转染后，用Western blot法来测定下她们的分子量，结果表明他们的分子量分别为65和83kDaNTE活性测定是在HEK293T cells中看GFP的表达。第10页/共22页 Distribution of GFP tagged cNTER and cNEST protein inmammalian cells因为cNTER and cNEST都用GFP来标记，所以cNTER and cNEST的分布可以用荧光显微镜直接分析出来第11页/共22页 荧光显微镜结果第12页/共22页 NTER和NEST分子量的测定第13页/共22页 不同处理因素对cNTER的影响第14页/共22页 第15页/共22页 第16页/共22页 Discussion相对于哺乳动物的PNPLAs，鸡的PNPLAs尚未引起足够的重视。尽管成年母鸡常被用作OPIDN的动物模型。但是关于NTE的排序和分子特征知道的很少。在目前的研究中，鸡的NTE被完整的分离出来，并且在氨基酸水平与人和小鼠有高度的相似性。另外，蛋白质结构和区域与人也有高度的相似性。第17页/共22页 An ER like localization of pcNTER-GFP was observed and cNTE was reasonably considered to be an ER-anchored protein. cNTE may be degraded by macroautophagy. 第18页/共22页 .C