四节细胞培养技术.pptxVIP

四节细胞培养技术;第四节 细胞培养技术;一、体外细胞培养技术 细胞培养（cell culture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。 优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变 ;IN VITRO:（离体的，即在玻璃容器中）用培养细 胞进行的实验 IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验 生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫IN VITRO，在活细胞内发生的生化反应叫IN VIVO ;;第6页/共41页;;第8页/共41页; 二、细 胞 融 合 技 术;（一）、细胞融合（cell fusion）：是指 将两个或两个以上的细胞合并形成一个细 胞的过程。 ; 异核体： 将两个不同类型的细胞融合，可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能，这种细胞叫异核体。常用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（PEG）人工促使融合。异核体进行有丝分裂则可产生杂种细胞。;（二）、单克隆抗体技术 B淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变为浆细胞产生抗体。每一个B淋巴细胞只能接受单一的抗原刺激产生特异性抗体,从单个B淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫 单克隆抗体(monoclonal antibody) 。 ; B淋巴细胞不能在体外无限增殖,故1975年k?ehler和Milstein利用杂交瘤技术,使绵羊红细胞(SRBC)免疫后小鼠的B淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合,建立产生抗SRBC单抗的杂交细胞株。它既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力,又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点,可不断在细胞培养上清液中产生单抗。 ; B淋巴细胞可产生抗体但在体外不易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，这种融合细胞即具有肿瘤细胞无限增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异抗体的能力，称为杂交瘤细胞。;第15页/共41页;第16页/共41页; 单克隆抗体在应用上的局限原因 1、完整Ig分子量大,难以穿透肿瘤组织,达 不到有效剂量 2、鼠源性抗体异质性 3、半衰期短,只有5～6小时 4、肿瘤细胞抗???性调变,抗体分子不能有 效地与肿瘤抗原结合,使效价下降 ;第五节 细胞分子生物学研究方法 ; 一、原位分子杂交技术 DNA变性:当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下,维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性。 DNA复性:当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。;第20页/共41页;第21页/共41页; 核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。;原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序 在其原位进行杂交,叫原位杂交。可 用于DNA、RNA定位研究。; 荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization,FISH）;二、聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR） 又叫体外基因扩增技 术。利用人工合成的 一对引物，在被扩增 DNA模板链的两端形成 双链，由DNA聚合酶催 化一对引物之间的聚合 反应。; 具体过程： ① 变性：将双链DNA加热（95℃）使 之变性，DNA双链变成单链 ② 退火：降低温度至56℃使引物与 模板DNA单链结合 ③ 延伸：将温度升至72℃，在DNA聚 合酶作用下，在引物3’端 进行延伸，使原模板DNA的 一条链变成两条链。;三、反义核酸技术 主要是引入mRNA的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列配对后 ，用于表达目的基因的mRNA量大大减少，使细 胞中靶基因编码的蛋白 合成量也大为减少;反义技术的应用： ① 基因功能的研究 ② 病毒基因组功能的研究 ③ 作为药物 ④ 抗肿瘤作用; 四、基因转移技术 将外源基因转移到受体菌或细胞内使之在细胞内实现转入基因的扩增或表