显微操作 定量注射器.docxVIP

实验：细胞显微注射技术 [实验目的] 了解细胞显微注射的基本原理 掌握细胞显微注射基本技术 [实验原理] 显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外 源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物 的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不 含有原核载体 DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达 100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基 因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主 DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建 立转基因动物极为重要的方法。 显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将 特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。 [仪器、材料和试剂] （一） 仪器和用具： 倒置显微镜（如 Nikon TMS 和 Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100 或 135，或Axioskop FS）； Leitz 重型基座（用于安放显微镜和微操作仪）； 微操作仪：Leitz（手动系统，安在平台上）或 Eppendorf 5171 （自动轴向微注射系统，可固定在显微镜的载物台上）； 微注射器：Eppendorf 5242 ，也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。 拉针仪：水平拉针仪 P87 型（如 Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉针仪 720 型（如 David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。 玻璃注射针头：可购买厂商拉制好的商品，也可用拉针仪自行拉制（可参照[方法与步骤]中的 1.1 注射针头的拉制）。 细胞培养设备：细胞培养箱、超净工作台、塑料平皿和盖玻片等。 （二） 材料： （三） 试剂： 缓冲培养基（含 25mmol/L HEPES pH7.2）；注射缓冲液（10mmol/L H2PO4-和 HPO42-，pH7.2， 84mmol/L K+，17mmol/L Na+，1mmol/L EDTA） [方法与步骤] 材料准备 注射针头的拉制 水平拉针仪：装上一根毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定 好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。 垂直拉针仪：把玻璃毛细管固定在上面的夹子上，使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹，固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。 使用拉针仪自行拉制的微注射针头，最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，从而引起针尖阻塞而影响注射。 盖玻片的处理 把盖玻片放在陶瓷或金属架上，相互不要接触。 在装有自来水的烧杯中，快速浸泡和冲洗。 在纸巾上把架子控干，再放入盛有 0.1mol/L HCl 的烧杯中，温育过夜。 用自来水冲洗盖玻片，每次 10min，共 5 次。 把架子浸入 70%的乙醇中，温育 60min。 用去离子水短暂冲洗，放在纸巾上控干。 在室温下自然干燥 30min。8 在 220～250℃烤 6 h。 显微注射用细胞的准备 在注射前一天，把细胞铺到直径为 10～15mm的盖玻片上，每个盖玻片 250～1000 个细胞。 在注射前，把带有需要注射细胞的盖玻片转移至新的组织培养皿中，迅速用金刚石笔在盖玻片上划 一个十字或一个圆圈标记（金刚石笔使用前用 70%乙醇冲洗，并在超净台中用火焰烧一下），然后加入 3ml 有缓冲液的培养基。 显微注射操作过程 针头装液 使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入 0.5～1μl的注射样品。 使用玻璃毛细管拉出毛细管针头，里面有与毛细管平行的细丝，有利于液体从后部向针头方向运动。只需在针头后部浸入 1mm 深度，不需使用手指或其他东西接触，就足以使少量的样品到达针尖部。 针头定位 将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。 把载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲培养基的平皿中，将其放在中央。 将培养皿放在显微镜载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区，这时光的亮度最好。 用低倍物镜对准细胞调焦。 将针头推入视野中心，在视野中针头呈阴影状。 轻轻的落下针头，直至到达培养基中后停下。 通过显微镜观察，移动针头，必要时调整微操作仪，直到针头的阴