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十章化学发光免疫分析技术第1页/共47页第2页/共47页第十章 化学发光免疫 分析技术第3页/共47页第十章 化学发光免疫 分析技术第一节 慨 述　一、化学发光　二、化学发光效率第二节 化学发光剂和标记技术　一、化学发光剂　二、发光剂的标记技术第4页/共47页第三节 化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床应用思考题小结第5页/共47页发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。 第6页/共47页第一节 概 述第7页/共47页三大经典标记技术放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术第8页/共47页 发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。 第9页/共47页 光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。 生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。第10页/共47页一、化学发光 化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。第11页/共47页 一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C＋ h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。 第12页/共47页若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h·γ第13页/共47页二、化学发光效率 化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。第14页/共47页第二节 化学发光剂和标记技术第15页/共47页一、化学发光剂 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。 第16页/共47页能作为化学发光剂的条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； ④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。第17页/共47页 ㈠直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。 第18页/共47页 1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物　N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 第19页/共47页2．三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。 三联吡啶钌第20页/共47页电化学发光剂反应原理 第21页/共47页 ㈡ 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。 1．鲁米诺及其衍生物 2．AMPPD第22页/共47页1．鲁米诺鲁米诺发光原理第23页/共47页鲁米诺增强发光反应原理 第24页/共47页2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕第25页/共47页二、发光剂的标记技术1. 碳二亚胺（EDC）缩合法 第26页/共47页2. 过碘酸钠氧化法 第27页/共47页3．重氮盐偶联法 第28页/共47页4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法 第29页/共47页影响标记的因素 1．发光剂的选择 2．被标记蛋白质的性质 3．标记方法的选择 4．原料