反相色谱中溶剂效应的原理及解决方法.docxVIP

PAGE2 / NUMPAGES2 反相色谱中溶剂效应的原理及解决方法 2023-02-1706:02 本文旨在对高效液相色谱中常见的溶剂效应的现象进行分析，探讨形成溶剂效应的原理，并提出相应的解决方法，为相关实践提供相应的指南。 一、概述 在紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法与气相色谱法三个领域中均有“溶剂效应”这一术语，分别具有不同的意义，由于篇幅有限，本文仅讨论高效液相色谱法最常用的反相色谱中的溶剂效应，其他如正相色谱、离子色谱、亲水作用色谱等可参考本文的分析方法与相关原理。 二、溶剂效应的概念 目前较为公认的对于溶剂效应的理解为稀释剂溶剂强度大于流动相时造成色谱峰变形的现象。如用纯乙腈溶解样品，注入流动相为乙腈-水（18:82）的反相系统中，会造成峰分叉或拖尾的结果。但是这种概念不能解释实践中其他由稀释剂导致的色谱行为异常现象，如溶出曲线研究中pH6.8溶出介质的溶出样品主峰峰型异常、或加入SDS助溶后峰分叉等情况，这些情况中稀释剂的溶剂强度并不一定大于流动相，但是却发生了色谱行为异常的现象。 鉴于许多由稀释剂导致的色谱行为异常现象不能用目前的溶剂效应进行解释，笔者认为有必要将溶剂效应的概念进行重新阐述：溶剂效应，是指由于供试品中特定组分在稀释剂与流动相中所处状态的差异对色谱行为的不利影响。如果这种不利影响较为严重，则可能造成明显的色谱行为异常，如峰分叉、拖尾等。 三、溶剂效应的表征 溶剂效应是一种对色谱行为的不利影响，影响程度不同，色谱行为的表征也各有不同；较轻的影响可能没有明显的色谱行为的异常如无法观察到的峰轻度展宽等，次一级的可能表现为峰明显展宽、低柱效，较为严重表现有特定组分峰保留时间不稳定、峰型异常、响应值不稳定等。 峰型异常是最直观也是最常见的溶剂效应的表现形式，如峰分叉、拖尾、前沿等。保留时间不稳定与响应值不稳定也是较为常见的表现形式，可能也会伴随峰型异常的情况；较为难以觉察到的溶剂效应是峰型正常只是响应值波动较大的情况，易误判为仪器故障等系统适用性方面的原因，如方法开发期间发现峰对称、但柱效较低且连续进样RSD较大，建议评估溶剂效应的风险。 溶剂效应具有一定的规律，如保留时间小的组分峰较易发生，多组分色谱图中出峰较晚的组分峰型较好、减少进样量一般可减轻等，在实践中可根据该规律对色谱行为异常是否为溶剂效应进行初步的判断。 四、溶剂效应的原理及解决方法 如上文所述，溶剂效应为特定组分在稀释剂与流动相中所处状态的差异对色谱行为的不利影响，差异主要包括洗脱能力、电离状态、离子缔合、互变平衡等。 1洗脱能力 这是目前一般意义上的理解，即上文提到的“纯乙腈溶解样品，注入流动相为乙腈-水（18:82）的反相系统中，会造成峰分叉或拖尾的结果”。如果稀释剂的洗脱能力大于流动相，则可能导致溶剂效应。 解决方法为调整稀释剂或流动相，使二者的洗脱能力接近或稀释剂的洗脱能力低于流动相。一般情况下，为避免洗脱能力导致的溶剂效应，反相色谱中较为稳妥的做法是稀释剂中有机相比例低于流动相或相当，必要时可略高于流动相，但应当评估其溶剂效应的风险，如根据上文提到的规律进行判断等。 2电离状态 药物活性成分很多都可以离子化，如苯磺酸氨氯地平、青霉素钾等，这类化合物绝大多数不是强电解质，只能部分电离；即电离平衡中一部分是离子状态另一部分是分子状态，两种状态在固定相与流动相的分配是不一样的。在反相系统中，分子状态与固定相结合更为紧密，保留更强；离子状态则更倾向于流动相，保留较弱。 设想一种情况，如果样品为碱性化合物，稀释剂为pH6.8缓冲盐溶液（溶出曲线研究较为常见），流动相为pH3.0的磷酸盐溶液-有机相系统，这有非常大的可能导致明显峰型异常的溶剂效应。因为样品在pH6.8缓冲盐溶液中的电离状态远低于pH3.0的磷酸盐溶液，供试品溶液与流动相混合的过程中，需要一段时间将电离状态从稀释剂缓冲至流动相的状态，如因某些原因（稀释剂是缓冲盐、流动相缓冲能力弱等）导致该时间较长，则待测组分峰极可能出现明显的峰型异常。 这种情况出现的溶剂效应解决办法一般有四种：更换稀释剂使稀释剂中待测物的电离状态与流动相一致或接近，减少进样量、在流动相中加入反离子或者增加流动相缓冲能力。缓冲能力相关内容参见拙著《方法开发缓冲盐选择指导原则》。 3离子缔合 这种情况常见于由于待测物溶解性差在稀释剂中含有十二烷基硫酸钠的试验中，待测组分峰可能严重变形，或者保留时间波动非常大。如果待测物为碱性化合物，则其原因为离子状态的待测物的阳离子与十二烷基硫酸根阴离子形成离子缔合物，该物质在反相色谱中保留相对于待测物极大增强；而在流动相中并不存在该缔合物，流动相消除该缔合物的影响时间如果较长，则会产生明显的溶剂效应。 简单的做法是更换稀释剂，如稀释剂不能更换，也可改变流动相，如在流动相