《玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP标记法》.pdfVIP

DB32/T XXXXX—2020 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：赵涵、张体付、吕远大、陈艳萍、林峰、陆海燕、梁帅强。 I DB32/T XXXXX—2020 玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP标记法 1 范围 本标准规定了利用 SNP （singlenucleotidepolymorphism）标记进行玉米品种及纯度鉴定的原理、仪 器设备及试剂、引物信息、操作步骤等要求。 本标准适用于玉米自交系、单交种及纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SNP 标记 singlenucleotidepolymorphismmarker 基于单核苷酸多态性的分子标记。 3.2 推荐引物 recommendedprimer 品种鉴定中优先选用的一套 SNP 引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。 3.3 竞争性等位基因特异性 PCR （KASP,KompetitiveAllele SpecificPCR） 通过引物末端特异性碱基竞争性匹配 DNA 模板实现 SNP 基因分型的链式聚合酶反应。 3.4 品种纯度 varietalpurity 品种在 DNA 分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占供检样品种子总 数的百分率表示。 1 DB32/T XXXXX—2020 4 原理 玉米基因组中普遍存在着单碱基的变异，不同品种同一 SNP 位点的基因型可利用适宜引物通过  KASP 检出，进而根据 SNP 位点基因型的差异鉴定品种及纯度。 5 仪器设备及试剂 见附录A。 6 引物信息 见附录B。 7 操作步骤 7.1 样品 DNA 提取 7.1.1 样品准备 试验样品种子的分样与保存，应符合GB/T 3543.2的规定。 7.1.2 用于品种鉴定样品 DNA 提取 从送检样品中随机抽取 10 粒种子发苗。分单株剪取 100 mg 幼苗用液氮研磨，将研磨粉末转入  2 mL 离心管，加入 0.5 mL 2×CTAB 提取缓冲液充分混匀。在55℃ ～65℃ 恒浴 30 min。加入 1 mL 氯 仿:异戊醇 （24：1），充分摇动 5 min，8 000 g，室温下离心 5 min。取上清液加入0.6×体积异丙醇，室 温下静置 30 min，5 000 g，4 ℃ 离心 5 min。沉淀用 0.8 mL 高盐缓冲液充分溶解，15 000 g 离心 2min。 上清加入 0.6×体积异丙醇，室温下静置 30 min，5 000 g，4 ℃ 离心 5 min。沉淀用 400 µL 双蒸水溶解， 加入 2.5×体积 95% 的预冷乙醇，﹣20 ℃ 冰箱放置 2h 以上，15 000g 离心 20min。用 70% 的预冷乙 醇洗一次，自然干燥后，用 200 μL 0.1×TE 缓冲液溶解，置 4 ℃ 保存。 注：以上为推荐用于品种鉴定的 DNA 提取方法，其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本标 准。 7.1.3 用于纯度鉴定样品 DNA 提取 按GB/T 3543.4规定的方法，从送检样品中抽取不少于 100 粒种子发苗。分单株剪取0.5cm～1cm 长的幼苗，