《分子生物学实验》教学课件合集（理论讲授、实验操作、实验流程）.pptx

分子生物学实验-理论讲授;概要;分子生物学的基本含义;分子生物学发展简史;;分子结构生物学 分子发育生物学 分子神经生物学 分子育种学 分子肿瘤学;基因工程;基因工程;基因工程的组成;10;11;12;基因工程实际应用的现状和展望;基因工程试剂的高回报;15;抗真菌病的转基因草坪;17;18;1;嗜热;21;22;人类基因组计划;24;基因工程的主要内容;基因工程的基本条件;载体;基因工程中的工具酶;限制性核酸内切酶;;;;;;;;;;;Taq DNA聚合酶;;;质粒的一般生物学特性;环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型： 超螺旋环状DNA（scDNA） 松弛开环DNA（ocDNA） 松弛线性DNA（L-DNA） 具有不同的电泳迁移率。 ;载体特点;遗传标记基因;2、?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 ;β—半乳糖苷酶(lacZ)基因有1021 AAs。该蛋白质可分为两部分：α链和β链分别由两个基因编码。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性。这两个部分可独立存在。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码?-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型?-半乳糖苷酶实现基因内互补（ ?-互补）。 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有生色指示剂(5－溴－4－氯－3－吲哚－?－D－半乳糖苷)X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 ;lacZα;蓝白斑试验（IPTG X-gal）;;pUC系列质粒;实验室常用的基因工程受体;;;基因工程实验需要掌握的技术;连接产物转化大肠杆菌感受态细胞;氯化钙法;琼脂糖凝胶电泳;PCR;重 组 子 的 筛 选;重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建;白细胞介素18;基因、载体、受体菌株;实验技术要求;实验流程: 第一天 8AM-5PM;67;实验流程: 第二天 8AM-5PM;实验流程: 第三天 1PM-5PM;实验流程: 第四天 8AM-5PM;思考题;72;73;74;75;76;Thank you for your attention!;重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建;基因、载体、受体菌株;实验技术要求;实验流程: 第一天 8AM-5PM （重组载体构建）;实验流程: 第二天 8AM-5PM （重组载体转化宿主细胞）;实验流程: 第三天 1PM-5PM（阳性转化子鉴别及转化效率检验）;实验流程: 第四天 8AM-5PM（含有目的基因重组载体的鉴定）;;Hybrid site;rhIL-18的PCR;双酶切反应（20μL体系）;培养基配制;灭菌;琼脂糖电泳;琼脂糖凝胶的配制;琼脂糖凝胶回收;1.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 2.向胶块中加入3倍体积溶液GSB（如凝胶重为100mg，其体积可视为100μL，依此类推）。55℃水浴放置6–10min，间断(2-3min)温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟，直至胶块溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。（将目的基因体积补至100μL，由此补平行操作。） 注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。;