三基因工程的基本条件工具酶和细胞.pptxVIP

3 基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的载体C用于基因转移的受体菌或细胞3 基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用hsd R：编码限制性核酸内切酶hsd M：编码限制性甲基化酶hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III （1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。① Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基② Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基限制性核酸内切酶限制修饰多功能单功能双功能辅助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG限制性核酸内切酶的类型主要特性I 型II 型III 型蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处 I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。如 EcoB和 EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。П型限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成,分子质量小,能识别DNA的特殊序列,种类多,在基因工程中起重要作用.III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACCEcoP15: CAGCAG在基因工程操作中用途不大。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株H i n d III H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点EcoR I的识别序列5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’EcoRI 37 ℃退火 4-7 ℃OHP5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’POHPstI等产生的3‘粘性末端5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’PstI 37 ℃5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’退火 4-7 ℃OHP5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’POH粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。② 5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可