酪蛋白制备及Barford测定实验.pdfVIP

酪蛋白制备及 Barford 测定 （一）酪蛋白制备 1、将 15 ml 牛奶加热到 40°C ；在搅拌下慢慢加入预热到40°C、pH4.6 的醋酸缓冲液 15 ml；用精密 pH 试纸调至 pH4.7。 2、冷却至室温，3500 rpm 离心 10min，弃上清，得酪蛋白粗品。 3、沉淀中加入去离子水 10 ml，搅拌均匀，3500 rpm 离心 10min，弃上清。 4、重复上述步骤三。 5、沉淀中加入 5 ml 98% 乙醇，搅拌均匀，3500 rpm 离心 10min，弃上清，加入无水乙醇洗涤一次， 作用时间不少于 5 min。 6、沉淀摊在表面皿上蒸干，得酪蛋白纯品。 7、分析天平称重，计算含量和得率。 （二）Barford 法测定蛋白质含量 一、标准曲线的制备 取 100μL BSA 标准溶液（5mg/ml）加入去离子水2.4ml 稀释至终浓度为 0.2mg/ml 将 6 支 10ml 试管编号，依次加入以下试剂，每加一种都要混合均匀 （平行三组）。 1 2 3 4 5 6 稀释 BSA 溶液（0.2 mg/ml ）μL 0 100 200 300 400 500 去离子水 μL 500 400 300 200 100 0 1X 考马斯亮蓝 G250 mL 5 5 5 5 5 5 显色反应 室温放置 5 min 需要可见光薄层 测定 A595nm 二、未知蛋白样品中蛋白质含量测定 1、取未知蛋白溶液 500μL，加入1X 考马斯亮蓝 G250 5 ml ，室温放置5 min ，测定A595nm （需做三 个平行试管）。 2、根据待测样品的OD 值，利用标准曲线计算蛋白含量，进而计算出未知蛋白的浓度。