生物化学核酸杂交.pptxVIP

生物化学核酸杂交;本章内容;核酸分子杂交的基本原理 ; 核酸变性 核酸复性 核酸杂交; 在化学和物理因素的影响下,维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA双螺旋解旋成为单链的过程. DNA变性后，理化性质和生物活性丧失。 ; 物理因素：热（高温） 化学因素：酸、碱； 变性剂（如尿素、胍）； 有机溶剂（如乙醇、丙酮）;（二）变性温度（或解链温度，Tm):; （1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)% （2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9 （4）变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的 形成，降低Tm值。; 变性的DNA两条互补单链,在适当条件下重新缔合成双链的过程，又叫退火。; 复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应（hypochromic effect）。;（1）DNA大小：片段越小，复性越快； 反之亦然。 （2）离子强度：增加盐浓度可加速复性。 （3）DNA浓度：浓度越大，复性越快。 （4）若变性不彻底，复性很快。 （5）序列越简单，复性越快。 ;DNA的变性和复性;三、核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) ; 杂交可以发生在 DNA/DNA、DNA/RNA、 RNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸单链与 DNA或RNA之间。;液相杂交: 进行杂交的核酸都在杂交液中 特点: 杂交速度快，但误差较高 固相杂交: 将参加反应的核酸先固定在固相支持物上，与杂交液中的游离探针进行杂交 ;; 第二节 核 酸 探 针 ; 探针的概念 探针的种类和选择 探针的标记;一、探针(probe)的概念;二、探针(probe)的种类;基因组探针：用基因克隆技术分离获得的特异的DNA序列。 RNA探针：特异DNA序列在体外转录出的RNA序列。 cDNA探针：以特异mRNA序列为模板，在逆转录酶催化下合成的cDNA序列。 寡核苷酸探针（ASO）：人工合成已知序列的寡核苷酸片段。;三、探针的标记物;四、探针的标记方法; 切口平移法（nick translation) 随机引物法 （random priming） DNA的5’末端标记 PCR标记法 ;第三节; 印迹杂交技术以固相杂交为基础.;一、固相支持物;二、印迹方法;三、印迹杂交过程;第四节; DNA印迹法 RNA印迹法 斑点杂交法 原??杂交 ; 主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。;两个主要过程： 一是印迹（blotting） 二是分子杂交;;DNA分子杂交实验;放射自显影照片; 将RNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探针进行杂交。; Northern blotting 的步骤;与DNA印迹的区别： DNA印迹是先电泳后变性、转移； RNA印迹是先变性后电泳、转移，且不能 采用碱变性;固定; 在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。 ;DNA点阵;本章重点:;44;感谢观看！