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(19)中华人民共和国国家知识产权局 *CN102816786A*
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 102816786 A
(43)申请公布日 2012.12.12
(21)申请号 201210165241.2 C12N 9/12 (2006.01)
(22)申请日 2012.05.25
(71)申请人 湖北大学
地址 430062 湖北省武汉市武昌区学院路
11 号
(72)发明人 钟星 翟超 马立新 余晓岚
严红 蒋思婧
(74)专利代理机构 武汉金堂专利事务所 42212
代理人 丁齐旭
(51)Int.Cl.
C12N 15/70 (2006.01)
C12N 15/54 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页
权利要求书1 页 说明书5 页 附图3 页
(54)发明名称
一种简单高效制备纯化TaqDNA 聚合酶的方
法
(57)摘要
本发明提出了一种简单高效制备纯化TaqDNA
聚合酶的方法。该方法操作步骤为:1)构建
TaqDNA 聚合酶表达载体pET-30aTAQ ;2)在卡那
霉素低盐LB 平板上转化TaqDNA 聚合酶表达载体
pET-30aTAQ 得到菌株BL21 (DE3)/pET-30aTAQ ;
3)接种到卡那霉素低盐LB 液体培养基中振荡培
养到OD600=0.4 ~0.9 ;4)IPTG 诱导2 ~24 小时;
5)离心收集培养基上清;6)将上清80 ~100℃加
热10 分钟后0 ~-20℃冰浴1 分钟;7)再用离心
收集上清;8)酶液经检测后冻存即为成品酶。本
发明的具有突出优点,纯化步骤仅需要两步离心,
一步热循环,方法简单。免除了传统方法的破菌
裂解程序和后续繁杂的纯化步骤。提高了TaqDNA
聚合酶的纯度,减少了污染,节约了制备成本,缩
A 短了生产周期,可以应用于连续在线固定化生产
6 TaqDNA 聚合酶。
8
7
6
1
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2
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1
N
C
CN 102816786 A 权 利 要 求 书 1/1 页
1. 一种简单高效制备纯化Taq DNA 聚合酶的方法,其特征在于步骤为:
1).构建Taq DNA 聚合酶表达载体pET-30aTAQ,pET-30aTAQ 为利用novagen 公司载体
pET-30a(目录号69909-3),在ECOR V 酶切位点插入Taq DNA 聚合酶基因得到;Taq DNA 聚
合酶基因编码产物UniProtKB/Swiss-Prot 编号为P19821.1 ;
2).在含有终浓度25-100ug/ml 的卡那霉素低盐LB 平板上转化Taq DNA 聚合酶表达
载体pET-30aTAQ 得到菌株BL21 (DE3)/pET-30aTAQ,37℃培养箱培养过夜;
3). 接种到补加终浓25 ~100ug/ml 的卡那霉素低盐LB 液体培养基中振荡培养到
OD =0.4 ~0.9 ;
600
4). 培养物中加入2 ~5mM 的IPTG 诱导7 ~24 小时;
5). 收集培养物,以相对离心力375 ~12000g 离心5 分钟小心收集培养基上清;
6). 将上清80 ~100℃加热10 分钟后0 ~-20℃冰浴1 分钟;
7). 以相对离心力375 ~12000g 离心5 分钟小心收集上清;
8). 酶液经检测后冻存即为成品酶。
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