基因工程3的学习教案.pptxVIP

基因工程3的学习教案; 基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应,特别是核酸内切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA连接酶(1igase)的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能。 ;一、寄主限制与修饰体系（R/M体系）;R/M定义：; 限制与修饰与三个连锁基因有关 hsd R编码限制性核酸内切酶 hsd M编码产物是DNA甲基化酶 hsd S表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。;寄主的限制与修饰有两个方面的作用 1、保护自身的DNA不受限制， 2、破坏外源DNA使之迅速降解。 细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身 DNA 与外源 DNA 的。;二、限制性内切酶(RE); 分类;1、 Ⅱ类RE;;HindIII H = genus Haemophilus in = species influenzae d = strain Rd III = third endonuclease isolated;2.识别序列; B 在某些5或6bp的识别序列中，存在内部简并或外部简并。 EcoR Ⅱ 可切割 CAGG CCGG 内部简并 CTGG XhoⅡ 可切割 R GATCY 外部简并 Y ： T或 C R ：A或G 简并不影响内切酶和甲基化酶的活性，增加了目标序列的频率;;;D 同尾酶;;;3. Ⅱ类限制性内切酶的切割方式及意义; ;C 从5’-3’链上对称轴右方切开和3’-5’链上对称轴 左方切开形成具有凸出的3’羟基基团的粘性末端;;;第24页/共62页;一些RE及其切割序列;;粘端补为平端 G AATTC G GAATT CTTAA G CTTAA CTTAA 粘端变为平端 CTGCA G G G G ACGTC ACGTC C ; 4. Ⅱ型RE的反应条件;（2）酶解过程;（2）酶解过程;RE 酶切反应的终止;5.影响RE活性的因素;（2）DNA甲基化程度 甲基化作用会强烈影响酶活性。 基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的 。 不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA来源 的细胞类型有密切关系。 用处： 1. 改变RE的识别序列的特异性。 2.酶切前保护内部识别位点;（3）酶切反应温度 不同RE具有不同的最适反应温度 一般为37 ℃ 也有例外 如 SmaI 25 ℃ ApaI 30 ℃ 高于可低于最适反应温度会导致酶失活;（4）DNA分子结构 超螺旋比线性DNA需酶量大，最高可达20倍 另外切割于不同DNA部位的限制位点时，效率也不同，但最多不会相差10倍;（5）RE 的缓冲液 缓冲液组分包括： ①Mg2+； ② Tris-Hcl 使pH处于最佳数值范围内 ③保护酶稳定性的物质 β-巯基乙醇、（DDT) 、（BSA);;5.RE对DNA的消化作用;（1）限制性内切酶对DNA的局部消化 理论上： 一条DNA分子上4种核苷酸量相等。 NNNN GATC ? x ? x ? x ? = 1/256 则 6 Base (?)6 = 1/4096