绿色荧光蛋白分子实验.pptVIP

绿色荧光蛋白分子实验;基本原理：多聚酶链式反应是DNA的体外酶促扩增。是利用两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，使目的DNA片段在一定时间以指数方式增加百万倍。;1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。 3、Mg2+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。 5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 6、循环数——过多易产生非特异扩增。;7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条