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操作培训 液相色谱基础知识;LC-20A Prominence;第一部分;色谱起源;色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱;色谱分类;色谱优点; 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用;HPLC分类;一、分配色谱 反相模式 (RP);相互作用力是什么?; 疏水性;反相模式下流动相的选择;增加流动相极性;固定相极性变化对分离的影响;分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm 峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯;离子对试剂 ;离子对色谱影响因素;正相色谱;相互作用力是什么?; 氢键力;正相模式下流动相的选择;增加流动相极性;反相色谱 流动相极性大于固定相极性 能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物 正相色谱 流动相极性小于固定相极性 不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混 合物和制备HPLC; ;二、离子交换色谱;离子交换色谱应用;体积排除色谱的分离机理;三、尺寸排阻色谱法（SEC）;第二部分;硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 填料床的长度和内径 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直径,通常3-10μm 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300? 碳百分率 与基体物质相连的键合相的量 封尾 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 ;硅胶特性;硅胶性质;表征色谱柱性能的参数;容量因子, k’;理论塔板数, N;分离度, Resolution;完全分离时的分离度 ;拖尾因子，T;第三部分;液相色谱简易流程图;采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配;水的等级;HPLC用水可以通过以下几个方法得到：;;有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯;;选择缓冲液的步骤 1 .确定最佳分离??态时的流动相pH 2 .选择具有与流动相pH相近的pKa 的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液） 3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 （在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液）;;缓冲液的使用;流动相的更换;;过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱， 尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸， 不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂; 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 ;;常用脱气方法;;LC-20AT 串联式柱塞往复泵;LC-20AT;LC-20AD;;泵工作示意图;单向阀结构;;;梯度洗脱装置： 高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。;;;梯度洗脱： 优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度 注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如 紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变 化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器） 查看空白实验的数据 遵守分析周期（最初的分析数据不采用） ;1. 使用流动相溶解样品 -- 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要